UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CONSELHO DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO

RESOLUÇÃO Nº 42/2015

O CONSELHO DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO, no uso de suas atribuições
legais e estatutárias,
CONSIDERANDO o que consta do Processo nº 12.788/2014-21 ­
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA/CCS;
CONSIDERANDO o que estabelecem os Artigos 5º e 10 do Estatuto
desta Universidade;
CONSIDERANDO, ainda, a aprovação da Plenária, por unanimidade,
na Sessão Ordinária do dia 11 de agosto de 2015,

R E S O L V E:

Art. 1.º Regulamentar as atividades do Núcleo de Bioengenharia Tecidual,
vinculado ao Centro de Ciências da Saúde desta Universidade.
Art. 2.º Revogam-se as disposições em contrário.

Sala das Sessões, 11 de agosto de 2015.

REINALDO CENTODUCATTE
PRESIDENTE

RC/VD/HF/RD

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ANEXO DA RESOLUÇÃO Nº 42/2015 ­ CEPE

NÚCLEO DE BIOENGENHARIA TECIDUAL

Anexo da Resolução nº 42/2015 ­ CEPE
Núcleo de Bioengenharia Tecidual
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Apresentação
O presente projeto trata da criação do Núcleo de Bioengenharia
Tecidual, cuja vinculação se dará com o Centro de Ciências da Saúde da
UFES. Inicialmente o referido Núcleo funcionará nas dependências do
Laboratório de Ultraestrutura Celular Carlos Alberto Redins (LUCCAR) do
Departamento de Morfologia, Prédio Básico I, até que possa captar recursos
para construção de sede própria. A partir da sua criação será gerado um
regimento próprio a fim de regulamentar suas atividades internas.
O objetivo principal do Núcleo de Bioengenharia Tecidual é o
desenvolvimento de órgãos in vitro para transplantação em seres humanos.
Dessa forma, objetivamos acabar com a fila de espera para transplantes.
Inicialmente, os estudos serão feitos em modelos experimentais murinos e
posteriormente, em órgãos de animais de grande porte, como porcos, para
posterior estudo com órgãos humanos, mediante aprovação do CEP/CONEP.
O Núcleo de Bioengenharia estará sob a coordenação do docente Breno
Valentim Nogueira e a vice-coordenação do docente Marco Cesar Cunegundes
Guimarães. O Núcleo contará com a presença de alunos de pós-graduação
(mestrandos e doutorandos), iniciação científica e pesquisadores
colaboradores.
A experiência científica do nosso grupo de pesquisa está associada a
terapia celular (células-tronco)/fatores de crescimento celular, como
demonstrado pelas recentes publicações na referida área:
1. CAMPAGNARO, BIANCA P.; TONINI, CLARISSA L.; NOGUEIRA, B. V. ;
Casarini, Dulce E.; VASQUEZ E.C.; Vasquez, Elisardo C.; Meyrelles, Silvana S.
DNA Damage and Augmented Oxidative Stress in Bone Marrow Mononuclear
Cells from Angiotensin-Dependent Hypertensive Mice. International Journal of
Hypertension, v. 2013, p. 1-10, 2013.
2. CAMPAGNARO, BIANCA P.; TONINI, CLARISSA L.; DOCHE, LUCIANO
M.; NOGUEIRA, B. V.; VASQUEZ E.C.; VASQUEZ, ELISARDO C.; Meyrelles,
Silvana S. Renovascular Hypertension Leads to DNA Damage and Apoptosis in
Bone Marrow Cells. DNA and Cell Biology , v. 32, p. 130620073411002,
2013.
3. Nogueira, Breno V.; Palomino, Zaira; Porto, Marcella L.; Balarini, Camille
M.; Pereira, Thiago M.C.; Baldo, Marcelo P.; Casarini, Dulce E.; Meyrelles,
Silvana Santos; Vasquez, Elisardo C. Granulocyte Colony Stimulating Factor
Prevents Kidney Infarction and Attenuates Renovascular Hypertension. Cellular
Physiology and Biochemistry , v. 29, p. 143-152, 2012.
4. Lima, Leandro C.F. ; Porto, Marcella L.; Campagnaro, Bianca P.; Tonini,
Clarissa L ; Nogueira, Breno V.; Pereira, Thiago M.C. ; Vasquez, Elisardo C.;
Meyrelles, Silvana S. Mononuclear cell therapy reverts cuff-induced thrombosis

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in apolipoprotein E-deficient mice. Lipids in health and disease
2012.

, v. 11, p. 96,

5. Porto, Marcella L.; Lima, Leandro C.F.; Pereira, Thiago M.C.; NOGUEIRA,
B.V.; Meyrelles, Silvana S.; Vasquez, Elisardo C.; VASQUEZ E.C. Mononuclear
cell therapy attenuates atherosclerosis in apoE KO mice. Lipids in health and
disease , v. 10, p. 155, 2011.
6. Pereira, Thiago M.C.; Nogueira, Breno V.; Lima, Leandro CF ; Porto,
Marcella L.; Arruda, Jose A.; Vasquez, Elisardo C.; Meyrelles, Silvana S.
Cardiac and vascular changes in elderly atherosclerotic mice: the influence of
gender. Lipids in health and disease , v. 9, p. 87, 2010.
A seguir, será descrito o projeto experimental inicial com estudos em
modelos murinos, para o desenvolvimento de corações e rins in vitro.

INTRODUÇÃO

A incidência de Insuficiência Cardíaca (ICA) e de Doença Renal Crônica
(DRC) tem crescido significativamente ao longo dos anos e continuará a elevarse progressivamente por causa do aumento da expectativa de vida da
população. A ICA e a DRC frequentemente coexistem, o que pode estar
relacionado a fatores de risco comuns, como, por exemplo, hipertensão,
diabetes e aterosclerose, mas também aos mecanismos patogênicos comuns,
tais como a ativação do sistema nervoso simpático, o sistema reninaangiotensina, a inflamação e o estresse oxidativo. A evidência também sugere
que a disfunção cardíaca pode causar a disfunção renal, e vice-versa (METRA
et al., 2012).
A ICA, é a maior causa de morte no mundo. Somente nos Estados
Unidos, mais de 5 milhões de pessoas sofrem de ICA, geralmente fatal,
principalmente por causa da escassez de órgãos para doação. Muitos
pacientes com ICA não respondem a terapias medicamentosas, havendo,
portanto, a necessidade de transplantes, como única forma de tratamento (LU
et al., 2013).
Similarmente,
milhões
de
pessoas
com
DRC
evoluem
subsequentemente para a falência renal, necessitando de transplante para
sobreviverem. Nos Estados Unidos existem cerca de 26 milhões de americanos
nessas condições e o número de novos casos de falência renal ultrapassa
90.000 anualmente (CORESH et al., 2007). No Brasil o cenário não é diferente.
De acordo com a Sociedade Brasileira de Nefrologia (SBN), existem
atualmente cerca de 92 mil pacientes em diálise no Brasil. Nos últimos 10 anos,
esse número cresceu 115% e deve aumentar em uma proporção de 500 casos

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por milhão de habitantes a cada ano. O gasto com o programa de diálise e
transplante renal no Brasil situa-se ao redor de 1,4 bilhão de reais ao ano.
Uma das novas promessas para o tratamento de ICA e da DRC é a
utilização de técnicas de engenharia tecidual para formação de estruturas
orgânicas, que consistem basicamente na descelularização do coração/rim
com a manutenção do arcabouço, preservando os constituintes da matriz
extracelular (MEC), posteriormente repovoada utilizando-se células-tronco.
Esse processo possibilita a criação de estruturas e órgãos, diminuindo o tempo
de espera na fila de transplantes, além de possibilitar a utilização desse
arcabouço recelularizado em testes pré-clínicos na pesquisa farmacêutica.
JUSTIFICATIVA
Sabe-se atualmente que existem milhões de pessoas à espera de
doadores de coração e rim. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS),
66.000 transplantes de rim e 6.000 transplantes de coração foram feitos no
mundo em 2005, porém o acesso dos pacientes aos sistemas de transplantes
varia de acordo com a situação de cada país e é determinado principalmente
pela disponibilidade de órgãos.
Como alternativa para aumentar o número de órgãos disponíveis e
consequentemente diminuir as filas de espera por transplantes, as técnicas de
bioengenharia tecidual estão se desenvolvendo cada vez mais com o intuito de
obter órgãos bioartificiais.
Estudos recentes têm demonstrado a obtenção de coração bioartificial
funcional por meio da descelularização e recelularização de órgãos
cadavéricos (OTT et al., 2008). Apesar dos estudos terem sido conduzidos em
murinos e primariamente no coração, alega-se que o conceito dos
experimentos pode ser aplicado ao coração humano e a outros órgãos. Outros
estudos demonstram a eficiência dos processos de descelularização para
coração e outros órgãos, com manutenção dos componentes da MEC e a rede
vascular, e a utilização dessa técnica na engenharia e na medicina
regenerativa (AKHYARI, et al., 2011; HE e CALLANAN, 2013; HREBIKOVA,
DIAZ e MOKRY, 2013).
Um dos problemas oriundos do transplante de órgãos é que, além da
necessidade de compatibilidade sanguínea entre o doador e o receptor, há
também o uso de medicamentos imunossupressores após a cirurgia, o que
pode levar ao aparecimento de outros agravos à saúde do paciente. Nesse
cenário, um benefício da descelularização é a redução do uso de
medicamentos e/ou moléculas imunologicamente ativas, o que permite,
consequentemente, a minimização das taxas de rejeição de transplante
(HREBIKOVA, DIAZ e MOKRY, 2013). Adicionalmente, a recelularização do
órgão com as células-tronco do próprio paciente também reduz a resposta
imunológica; portanto, há queda do uso de imunossupressores, o que reduz os
gastos com esse tipo de droga.
Assim, preferivelmente ao processo de geração de novo órgão
(JORAKU et al., 2009; LITTLE, 2006; YOKOO, MATSUMOTO e YOKOTE,
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2011), estudos têm demonstrado com sucesso a repovoação de arcabouços
acelulares com células de vários outros tecidos (ATALA, 2006; BHRANY et al.,
2006; MATSUNUMA et al., 2006; OTT et al., 2008).
Assim, pela mimetização do procedimento de descelularização de um
órgão retirado de um rato e subsequente recelularização (repovoação) da
matriz extracelular com células do próprio animal, um órgão bioartificial
funcional pode ser obtido. Então a engenharia de tecidos ajudaria a preencher
essa lacuna pela regeneração do órgão danificado, usando arcabouços
repovoados com células precursoras (BONANDRINI et al., 2014).
OBJETIVOS
Objetivo geral
O objetivo desse projeto é o desenvolvimento de um coração e de um
rim bioartificial e funcional, com a manutenção dos componentes da matriz
extracelular (MEC).
Objetivos específicos
Cultura de células-tronco mesenquimais retiradas da medula óssea e do
tecido adiposo de ratos;
Padronização de técnicas de descelularização de coração e rim de ratos
para formação do arcabouço, contendo componentes da matriz
extracelular;
Obtenção de um arcabouço descelularizado viável para repovoamento
com células-tronco mesenquimais;
Repovoamento do coração e do rim com células-tronco mesenquimais;
Verificação da eficiência do processo de repovoamento celular.
METODOLOGIA
Animais
Serão utilizados 30 ratos machos adultos Wistar. Esses animais serão
mantidos no Biotério Central do Centro de Ciências da Saúde, localizado no
campus da UFES em Maruípe, até os primeiros 60 dias de vida, pesando cerca
de 250 gramas. Os animais serão mantidos em gaiolas, em ambiente com
regime de ciclo claro/escuro (12h/12h), com temperatura e umidade
controladas, água e ração comercial para animais experimentais ad libitum.
Os animais serão utilizados de acordo com normas estabelecidas por
entidades científicas nacionais e internacionais. Após os experimentos, os
animais sacrificados serão colocados em sacola de plástico branco com a
identificação de risco biológico. Os animais serão acondicionados em freezer a
-20ºC até a coleta da Prefeitura de Vitória.

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Procedimento para Retirada dos Órgãos
No 60.º dia após o nascimento, os animais serão previamente pesados,
segregados em gaiolas individuais identificadas e posteriormente anestesiados
com a administração intraperitoneal (i.p.) de sobredose de solução anestésica
contendo ketamina e xilazina (9/1). Após a constatação visual da completa
indução anestésica, proceder-se-á à laparotomia e à esternotomia para que
sejam acessados os órgãos internos. Serão retirados os rins, o coração, o
tecido adiposo, o baço, o fígado e os membros inferiores (ossos).

Descelularização
Uma vez que os animais tenham sido selecionados, os órgãos obtidos
serão descelularizados com detergentes. Essa etapa poderá ser acompanhada
pela primeira perfusão da matriz com SDS, um detergente iônico comumente
utilizado em descelularização, que atua como surfactante, lizando as células. A
matriz será então perfundida com Triton X-100, um detergente não iônico. Esse
processo tem conseguido remover mais de 96% de todos os resquícios de
DNA (ROSS et al., 2012).

Fonte Celular
O próximo passo nesse processo é a obtenção de células-tronco para a
colonização da matriz. Células-tronco derivadas da medula óssea (BMSCs) e
de tecido adiposo (ASCs) têm se diferenciado de células nativas de órgãos
(IMAI e ITO, 2002; YAMADA et al., 2014).
As BMSCs e as ASCs serão cultivadas em meio enriquecido com soro fetal
bovino (10%) em DMEM com acréscimo de penicilina e estreptomicina.
Atingida a confluência, essas células serão mantidas em subculturas até a
utilização necessária.

Repovoamento
As células-tronco provenientes da cultura celular serão perfundidas
retrogradamente no arcabouço por meio dos vasos que constituem esses
órgãos. No caso do coração, as células serão inoculadas através da artéria
aorta no limite do arco aórtico no tronco braquicefálico. Analogamente, no caso
dos rins, as células-tronco serão perfundidas de forma retrógrada através dos
ductos coletores. Isso resultará em células tubulares que revestirão os ductos
coletores e os túbulos renais. Podócitos serão perfundidos através do sistema
de vasos sanguíneos do rim descelularizado, utilizando-se um meio de cultivo
oxigenado. Pretende-se que essas células sejam localizadas na cápsula de
Bowman por causa da composição peculiar da matriz. Em seguida, as células
mesangiais serão adicionadas à solução de perfusão. Essas células iniciarão a
confecção da linha de vasos sanguíneos presentes no rim. Posteriormente, as
células endoteliais serão adicionadas à linha interna dos vasos sanguíneos.

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Caracterização e Validação do Coração e do Rim Recelularizados
As BMSCs e APCs serão imunomarcadas e coradas com CD34, CD133,
c-Kit e GATA-4 para comprovarmos realmente a sua origem, qual seja, célulastronco derivadas da medula óssea e do tecido adiposo. Após a diferenciação
das BMSCs e das ASCs em cultura celular, as células serão isoladas mediante
imunosseleção com anticorpos monoclonais (mABs) como, por exemplo, ST.12
(FEJES-TÓTH e NÁRAY-FEJES-TÓTH, 1992). As células que obtiverem
tempo de ciclo celular lento serão distinguidas pela retenção de um marcador
nucleotídico, a bromodeoxiuridina (BrdU), incorporada no DNA das células
durante a síntese de DNA (OLIVER et al., 2004). Após a administração de
BrdU as células serão monitoradas por determinado período; apenas as células
com tempo de ciclo celular lento reterão quantidades de BrdU suficientemente
altas para permitir sua marcação e consequente identificação.

REFERÊNCIAS
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decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization
technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.
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doi:10.1089/ten.TEC.2011.0210, 2011.
ATALA, A. Recent applications of regenerative medicine to urologic structures
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scaffold. Tissue Eng, v. 12, p. 319­330, doi:10.1089/ten.2006.12.319, 2006.
BONANDRINI, B. et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney
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CORESH, J. et al. Prevalence of chronic kidney disease in the United States.
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FEJES-TÓTH, G. e NÁRAY-FEJES-TÓTH, A. Differentiation of renal betaintercalated cells to alpha-intercalated and principal cells in culture.
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HE, M. e CALLANAN, A. Comparison of methods for whole-organ
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Part B, Reviews, v. 19, n. 3, p. 194­208, doi:10.1089/ten.TEB.2012.0340, 2013.
HREBIKOVA, H.; DIAZ, D.; MOKRY, J. Chemical decellularization: a promising
approach for preparation of extracellular matrix. Biomedical papers of the
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IMAI, E. e ITO, T. Can bone marrow differentiate into renal cells? Pediatric
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LU, T.-Y. et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced
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MATSUNUMA, H. et al. Constructing a tissue-engineered ureter using a
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Tissue
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METRA, M. et al. The role of the kidney in heart failure. European heart journal,
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ROSS, E. A. et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney
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YAMADA, A. et al. Comparison of multipotency and molecular profile of MSCs
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YOKOO, T.; MATSUMOTO, K.;YOKOTE, S. Potential use of stem cells for
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Disponível em: < http://www.who.int/bulletin/volumes/85/12/06-039370/en/ >.

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