Matriz colagênica de tendão bovino como potencial
biomaterial para bioengenharia de tecidos
Collagenic matrix from bovine tendon as a potential biomaterial for tissue bioengineering
Kellen Cristina da Silva GASQUE1, Alysson Martins CORREA 2, Tania Mary CESTARI3, Rumio TAGA4,
Rodrigo Cardoso de OLIVEIRA5, Willian Fernando ZAMBUZZI6, José Mauro GRANJEIRO7

Resumo
A Engenharia de Tecidos é um campo interdisciplinar que busca
preservar, restaurar ou criar um tecido funcional, apoiandose em três elementos fundamentais: células, fatores tróficos
e carreadores. Um desses elementos, que ainda permanece
sob intensa investigação, é o carreador. O objetivo do
trabalho foi avaliar o comportamento tecidual ao implante
de membrana colagênica derivada de tendão bovino em
subcutâneo de camundongos. Nos animais do grupo controle
foi feita apenas a incisão, divulsão e sutura. Depois de 3, 7,
15, 30 e 60 dias, os camundongos foram eutanasiados por
dose excessiva de anestésico, sendo os tecidos reacionais
coletados para análise histológica. Foram observados os
seguintes parâmetros: biodegradação em relação ao tempo,
vascularização, integração tecidual e reação de corpo estranho.
O tecido adjacente ao material implantado apresentou
infiltrado inflamatório nos períodos iniciais, com angiogênese e
proliferação fibroblástica. No grupo experimental constatamos
uma moderada reabsorção da membrana nos períodos de
15 e 30 dias e absorção completa aos 60 dias. A absorção foi
mediada por células tipo macrófagos, sem a necessidade de
células gigantes. Concomitantemente, houve a regeneração
tecidual. No grupo controle observamos resultados compatíveis
com o procedimento operatório, mostrando formação de
coágulo e rede de fibrina nos primeiros períodos, proliferação
angioblástica e fibroblástica nos períodos seguintes e
regeneração tecidual nos 2 últimos períodos analisados. Diante
dos resultados obtidos, podemos concluir que a membrana de
tendão bovino é biocompatível e reabsorvível, posicionandose como um promissor material a ser explorado pela medicina
regenerativa.
Palavras-chave:
Colágeno.

Membranas.

Engenharia

Abstract
Tissue Engineering is an interdisciplinary field that seeks to
preserve, restore or create a functional tissue, relying on
three key elements: cells, growth factors and carriers. Thus,
our objective was to evaluate the reactional tissue induced
by collagenic matrices derived from bovine tendon in the
subcutaneous tissue of mice. Thereafter, the animals were
killed at 3, 7, 15, 30 and 60 days post-surgery of implantation
and tissues collected for histological analysis for analyzing:
biodegradation, angiogenesis, tissue integration and foreign
body reaction. The reactional tissue showed a moderate
inflammatory infiltrate, with angiogenesis and fibroblastlike cells proliferation, while a moderate resorption of
the membrane was found at 15 and 30 days and it being
complete at 60 days. Our results suggest that the absorption
was mediated by mononuclear cells such as macrophages,
without giant cells involvement. Based on these results,
we conclude that the membrane of bovine tendon is
biocompatible and absorbable, it being a promising material
to be exploited for regenerative medicine.
Key words: Membranes. Tissue engineering. Collagen.

tecidual.

Endereço para correspondência:
José Mauro Granjeiro
Av. Nossa Senhora das Graças, 50
Prédio 6 ­ Sala da DIPRO ­ 1º. andar
Xerém
25250-020 ­ Duque de Caxias - Rio de Janeiro - Brasil
E-mail: [email protected]
Recebido: 01/02/2011
Aceito: 06/04/2011
1. Doutoranda em Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
2. Cirurgião-dentista, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
3. Doutora em Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
4. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
5. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
6. Professor, Universidade UNIGRANRIO, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Pesquisador, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de
Caxias, RJ, Brasil.
7. Pesquisador Sênior, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Professor Adjunto do Núcleo de Terapia Celular,
Hospital Universitário Antônio Pedro, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.

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artigo ORIGINAL

Gasque KC da S, Correa AM, Cestari TM, Taga R, Oliveira RC de, Zambuzzi WF, Granjeiro JM

INTRODUÇÃO

MATERIAL E MÉTODOS

A Engenharia de Tecidos é um campo interdisciplinar, no
qual os princípios de biologia, química, engenharia etc. são
aplicados em razão da geração de substitutos biológicos que
buscam: preservar, restaurar ou criar um tecido funcional11.
Classicamente, a engenharia de tecidos tem se apoiado em
três elementos fundamentais: células, moléculas sinalizadoras
e carreadores 4 . No entanto, um desses elementos que ainda
permanece sob intensa investigação, é o carreador, variando
de acordo com suas necessidades13. Um material apresentado
como forte candidato a essa função é o colágeno13.
A prevalência do colágeno nos tecidos humanos o habilita
como um polímero para a confecção de materiais biomédicos
para medicina regenerativa. O colágeno é a proteína mais
abundante presente nos mamíferos, compondo 30% em peso de
todas as proteínas corpóreas. É biodegradável, biocompatível,
melhora a migração celular e o reparo de áreas cirúrgicas6. Seu
valor potencial como biomaterial tem levado a pesquisas sobre
o uso de carreadores para reparação de ligamentos, tratamento
de queimaduras extensas, enxertos teciduais e engenharia de
tecidos osteo-cartilaginoso1,9,18 .
Diversas são as abordagens relativas ao uso de carreadores
na Engenharia Tecidual. Uma das aplicações de carreadores
colagênicos é em cirurgias de reparo de fissura palatina, na qual
a implantação de uma membrana pode evitar a formação de
escaras e, consequentemente, um crescimento tecidual irregular8 .
Devido a sua biocompatibilidade e segurança bem
relatados na literatura, o colágeno representa uma matriz
favorável como carreador nos sistemas de liberação de
antibióticos, cujas principais indicações são no tratamento e
profilaxia do osso, reparação tecidual, assim como tratamento
oftalmológico e periodontal17.
O colágeno poderia ser um carreador adequado para célulastronco mesenquimais humanas na indução osteogênica, na
engenharia tecidual de tecido ósseo funcional. Seus resultados
foram comprovados pela expressão de mRNA de BMP-2 em
resposta à tensão em células mesenquimais humanas cultivadas
em um gel tridimensional de colágeno19.
A origem do colágeno pode resultar em diferentes
características do material e consequentemente respostas
distintas do tecido receptor, como por exemplo, o tempo de
absorção do colágeno implantado e a presença de proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs)14-15.
Assim sendo, nossa proposta avaliou a resposta tecidual
induzida por uma membrana colagênica derivada de tendão
bovino implantada em tecido subcutâneo de camundongos,
para uso como carreador na Engenharia de Tecidos.

MATERIAL
Esse estudo seguiu as disposições do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) tendo sido aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisas com Animais da FOB-USP (Bauru).
A membrana, processada em nosso laboratório (Laboratório
de Bioquímica, Depto de Ciências Biológicas, Faculdade de
Odontologia de Bauru - USP), é composta de tendão bovino,
predominantemente colágeno tipo I. Inicialmente o tendão bovino
foi submetido à limpeza mecânica e química para remoção
de material potencialmente imunogênico e de células, sem a
promoção de ligações cruzadas. As membranas (Figura 1) foram
liofilizadas, cortadas, embaladas e encaminhadas para esterilização
por radiação gama (25 kGy, EMBRARAD S.A., Sorocaba, SP, Brasil).

Figura 1 - Aspecto macroscópico da membrana derivada de
tendão bovino, predominantemente colágeno tipo I.

ANIMAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados cinquenta camundongos machos adultos
jovens, da linhagem Swiss, pesando aproximadamente 30 g,
divididos em 2 grupos: Controle e Experimental.
Os animais foram preparados e pré-medicados conforme
anteriormente descrito5. Depois de adequada assepsia, os animais
receberam uma incisão de 1,5 cm no tegumento do dorso, expondo
o tecido subcutâneo, que foi imediatamente divulsionado com uma
tesoura de ponta romba. Uma membrana de 1 cm2, previamente
embebida em soro fisiológico por aproximadamente 1 minuto, foi
implantada, mantendo-se uma distância de aproximadamente 1
cm das margens da incisão. Vários pontos simples e descontínuos
foram dados com fio de seda Ethicon número 4.0 (Johnson &
Johnson®, São Paulo, SP, Brasil). O grupo controle foi submetido
aos mesmos procedimentos cirúrgicos do grupo experimental sem
a colocação da membrana. Os animais foram mantidos durante
todo o período experimental, em caixas plásticas forradas com
maravalha (trocadas três vezes por semana) e alimentados com
ração adequada ad libitum.

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Matriz colagênica de tendão bovino como potencial biomaterial para bioengenharia de tecidos

COLETA, PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO E ANÁLISE
MICROSCÓPICA DAS PEÇAS
Os animais foram submetidos à eutanásia após 3, 7, 15, 30
e 60 dias dos procedimentos cirúrgicos. O tecido reacional de
cada animal foi removido, fixado por 48 horas em formol a 10%
tamponado, processado segundo a técnica histológica convencional
para inclusão em parafina. Cortes histológicos com espessura de
5 µm foram obtidos e corados com hematoxilina-eosina (H.E).
A resposta tecidual à membrana foi analisada em função das
alterações inflamatórias (presença de edema, alterações vasculares
e infiltrado inflamatório) e dos processos reparatórios (grau de
fibrosamento, proliferação angioblástica e fibroblástica) nos tecidos
reacionais juntos aos materiais implantados.

de macrófagos aumentado no tecido reacional (Figura
2C). Concomitantemente, havia uma intensa proliferação
fibroblástica, provavelmente em decorrência da regeneração
tecidual. No grupo controle o tecido já se apresentava
completamente regenerado, sem sinais de inflamação.
60 dias
Nesse período, não foi possível observar a membrana na
maioria dos animais do grupo experimental (Figura 2D), apenas
áreas sugestivas de resquícios fagocitários do material.

RESULTADOS
O material mostrou-se biocompatível, com alta taxa de
degradação, permitindo a invasão de células. Em relação à resposta
inflamatória, não houve diferença entre os grupos controle e
experimental, mostrando que a resposta inflamatória foi uma
decorrência do procedimento cirúrgico realizado.
3 DIAS
Neste período, o material apresentou-se íntegro, com uma
fina rede de fibrina e infiltrado inflamatório moderado, este último
em ambos os grupos. O tecido reacional adjacente ao material
implantado apresentava uma quantidade moderada de macrófagos
na periferia do material, mas sem a presença de células gigantes
multinucleadas inflamatórias.
7 DIAS
Foi observado a presença de infiltrado inflamatório moderado
no grupo experimental e leve no grupo controle (Figura 2A).
Presença moderada de macrófagos ao redor da membrana, que
já apresentava regiões de degradação. Neste período foi possível
notar, em alguns dos animais, o início da formação de uma fina
cápsula fibrosa.
15 dias
Neste período, observamos o crescimento celular (sugestivos
de filbroblastos) nos poros apresentados pelo material (Figura 2B),
além de eventos angiogênicos. Além disso, o material apresentava
intenso estado de degradação, com superfícies irregulares. Cabe
destacar que este processo foi paralelo ao aumento do número de
macrófagos. Neste cenário, não foi observado a presença de células
gigantes multinucleadas. Paralelamente, o grupo controle começava
a aparentar sinais de normalidade tecidual, principalmente pela
diminuição do infiltrado inflamatório.
30 dias
Nesse período, a membrana de colágeno estava em
estágio avançado de degradação, ainda com o número

18

Figura 2 - Grupo experimental nos períodos de 7 dias (A), 15
dias (B), 30 dias (C) e 60 dias (D). Podemos notar, em A, que
a membrana (M) começa a ser invadida por células (cabeças
de setas), apresentado sua superfície externa envolta por
densa camada de células inflamatórias (setas). Observar, em
B e C os resquícios da membrana implantada (*) na região
subcutânea. Em C notamos indícios da degradação (circulo
pontilhado) das fibras colagênicas da membrana (*). Em D
notamos as características de um tecido em estágio final de
reparo. Coloração HE. Aumentos: A, B e D 40x e C 100X.

DISCUSSÃO
Os materiais colagênicos têm sido utilizados na área
da saúde devido a sua biocompatibilidade e capacidade de
auxiliar mecanismos de reparo tecidual3. De um modo geral,
um material absorvível adequado para procedimentos orais
deve facilitar a adesão, proliferação e migração celular com o
intuito de impedir sua exposição à microbiota bucal, mesmo
nos casos de exposição da membrana, além de estabilizar o
coágulo formado 2 .
A cultura de fibroblastos gengivais humanos foram avaliadas
sobre diversas membranas, tanto absorvíveis (colagênicas) quanto
não-absorvíveis (PTFEe) e observaram que os materiais colagênicos
apresentaram resultados superiores, estimulando a proliferação
celular. Esse trabalho corrobora com nossos achados, uma vez que
a membrana de pericárdio permitiu a proliferação fibroblástica e
angioblástica apresentadas no processo de reparo10.

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Os fibroblastos de diferentes espécies, assim como
células precursoras ósseas foram capazes de se aderirem às
membranas colagênicas, independente da origem do colágeno
e do tipo de tratamento recebido. Esses resultados reforçam a
biocompatibilidade dos materiais colagênicos e vão de encontro
aos achados em nosso trabalho, onde pudemos verificar o
contato íntimo de fibroblastos com o material implantado2.
Com o intuito de se obter um material adequado e acessível,
testamos uma membrana colagênica de tendão bovino que
pudesse ser usada como possível carreador celular na Engenharia
Tecidual, bem como nas técnicas de RTG e ROG (Regeneração
Óssea Guiada). A membrana foi preparada sem a adição de
glutaraldeído (conhecidamente utilizado para a formação de
cross-links entre as moléculas de colágeno), principalmente para
evitar alguns problemas decorrentes desse procedimento, como
a própria liberação de glutaraldeido durante a proteólise do
colágeno, comprometendo a resposta celular15 e a calcificação
do material12. No entanto, uma das grandes vantagens das
reações cruzadas é que elas prolongam o tempo de absorção
do material, fator especialmente importante no caso da ROG.
Percebemos que a membrana de tendão bovino apresentou uma
alta taxa degradativa quando implantada em subcutâneo. Esta
característica é bastante relevante no tocante ao carreamento
de células, em protocolos de bioengenharia tecidual.
Além disso, nossos resultados corroboram um trabalho
realizado16 que demonstrou que as membranas colagênicas
sem reações cruzadas apresentaram uma perfeita integração
tecidual e, desse modo, uma rápida vascularização, culminando
em uma absorção total em 4 semanas depois da implantação,
sem serem observadas reações do tipo corpo estranho.
A alta absorção do material, no presente trabalho, é
decorrente da atividade enzimática oferecida por células
fagocitárias como leucócitos e macrófagos, estes últimos
sugeridos pela análise histológica. Em substituição ao
material absorvido, ocorreu o povoamento da região células
fibroblastóides, confirmando algumas características já descritas
para esta resposta biológica3.
Finalmente, um carreador adequado para a Engenharia de
Tecidos deverá fornecer estabilidade mecânica inicial, permitindo
uma adequada interação com elementos celulares7. A membrana
testada no presente trabalho, por ser tratar de colágeno tipo I,
possivelmente trará bons resultados de interação com células
ex-vivo, posicionando-se como uma promissora alternativa a ser
considerada em ensaios de bioengenharia tecidual.

CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos neste estudo, podemos
concluir que a membrana de tendão bovino é biocompatível e
absorvível.

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