Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar - UP
Mestrado Integrado em Bioengenharia
Ter
modinâmica - 2014 / 2015
ermodinâmica
José Augusto Pereira
I NTRODUÇÃO À ESPECTROFOTOMETRIA DE DNA
Deter minação da entalpia e da entropia padrão de emparelhamento de um
oligonucleótido. O efeito da concentração de NaCl.
Introdução
Espectrofotometria de ultravioleta-visivel (UV
(UV--Vis)

O espectro electromagnético
A radiação electromagnética é constituída por quanta de energia, os fotões, que apresentam comportamento ondulatório. Estas partículas elementares são as intermediárias da interacção e da força electromagnética e a
sua energia pode ser calculada pela equação 1:
E = h

(1)

-34
­1
onde h é a constante de Planck (6,62618 x 10 J s) e é a frequência da radiação (s , o mesmo que Hz).
O comprimento de onda fica definido pela frequência e pela velocidade da radiação através da equação 2:

= c /

(2)

onde é o comprimento de onda (m) e c é a velocidade de propagação da onda (2,9979 x 108 m s-1 no
vácuo). A energia da radiação electromagnética é portanto directamente proporcional à sua frequência e inversamente proporcional ao seu comprimento de onda.

Figura 1 - Espectro de frequências
para a radiação electromagnética. Um
­9
nanómetro (nm) é 10 m .

1

Figura 2 - Transições electrónicas entre orbitais moleculares (OM)
de diversos tipos. Numa molécula estável, as orbitais ligantes e , e
as não-ligantes n, contêm electrões, enquanto que as OM anti-ligantes
*e *estão vazias. As transições que requerem maior energia, e
portanto fotões de maior frequência, são as
*. As transições envolvendo OM tipo só ocorrem quando a molécula contém
ligações duplas ou triplas. As OM tipo n são na verdade orbitais
atómicas, simples ou híbridas. Por normalmente terem maior energia
potencial que as OM ligantes, as orbitais n estão na origem de algumas das transições electrónicas de menor energia.

O estudo de diversas fontes de radiação mostra que esta é constituída por fotões com diversos comprimentos de onda que habitualmente se classificam em intervalos cujo nome tem a ver com a sua utilização ou
percepção humana (figura 1). Deve notar-se que a região visível é uma pequeníssima parte do espectro electromagnético, compreendendo radiações de comprimento de onda entre 400 nm (radiação violeta) e 800 nm
(radiação vermelha), aproximadamente. Os comprimentos de onda da radiação electromagnética solar variam
4
-16
entre cerca de 10 m (ondas de rádio) a 10 m (raios ).

Excitação electrónica
A radiação electromagnética interage de diversas formas com a matéria, dependendo da sua energia e
do tipo de matéria. Uma destas interacções dá-se ao nível das transições electrónicas entre orbitais atómicas ou
moleculares quando a radiação possui comprimentos de onda nas regiões do ultravioleta e visível, entre 200 e
800 nm. Em moléculas, este fenómeno consiste na promoção de electrões de orbitais moleculares (OM)
ligantes (tipo ou ) ou não-ligantes (tipo n) para OM anti-ligantes de maior energia, de onde deriva o nome
"excitação electrónica". Estas transições podem representar-se por:
*,
*, n
* e

* (figura 2). As transições para OM anti-ligantes podem provocar a desagregação molecular designada por fotólise.
Os hidrocarbonetos saturados só apresentam transições do tipo
*, que requerem uma energia
muito alta, razão pela qual estes compostos absorvem radiação na região do ultravioleta longínquo ( < 150 nm).
A presença de ligações duplas fazem com que apareçam máximos de absorvância a comprimentos de onda mais
altos (tabela 1) correspondendo a energias de transição mais baixas.
A presença de outros átomos, como o oxigénio nos aldeídos e nas cetonas que possuem electrões em
orbitais n e (grupo C=O) provocam absorção de radiação entre 180 e 280 nm, devido às transições
n
* e
*. Compostos diferentes mas possuindo o mesmo tipo de grupos cromóforos (com
absorção característica no ultravioleta ou visível), normalmente absorvem energia de comprimentos de onda difeTabela 1 - Comprimento de onda da radiação electromagnética absorvida por
hidrocarbonetos simples e substituídos com
halogéneos. A presença de ligações duplas
e triplas e os pares de electrões não ligantes
nos halogéneos provoca o aparecimento de
transições a maiores comprimentos de onda.

2

Figura 3 - Máximos de absorvância para várias enonas. A presença do grupo carbonilo e a conjugação de ligações duplas está
directamente relacionada com o aumento do comprimento de onda a que aparece o máximo de absorvância. As moléculas assinaladas,
com um grupo carbonilo e quatro ligações duplas conjugadas têm máximos de absorvância já muito perto do visível (~400 nm).

rentes, tal como pode ser verificado na figura 3. Na realidade, a energia necessária para as transições electrónicas
depende da estrutura global da molécula, sendo relevante a natureza dos grupos vizinhos do grupo cromóforo, ou
a existência de conjugação de orbitais entre vários átomos. Nesta última situação a molécula absorve energia de
maior comprimento de onda, que pode inclusivamente chegar a ser radiação visível quando a conjugação é
extensa. Os compostos que absorvem radiação na região do visível são corados e as suas moléculas apresentam
sistemas de electrões extensos e conjugados. São exemplos de moléculas biológicas deste género os carotenos
e as clorofilas (figura 4). Outra fonte de côr está nas transições presentes nos compostos de coordenação com
catiões metálicos de transição, como ferro e cobre, por exemplo.

Espectrofotometria
Para obter espectros como os da figura 4 utiliza-se um espectrofotómetro. Este é um aparelho que emite
um feixe de luz com um determinado comprimento de onda para uma amostra, segundo o esquema representado na
figura 5, e mede a quantidade de luz absorvida. A quantidade de radiação que uma solução deixa passar ao ser
atravessada por um feixe luminoso denomina-se transmitância (T ), e corresponde ao rácio entre a intensidade da
luz emergente da solução (I ) e a intensidade da luz incidente (I0):
T = I / I0

(3)

A transmitância está relacionada com outra grandeza, a absorvância (A), pela expressão:

A = log (1/T ) = log (I0 / I )

(4)

A análise quantitativa (ou doseamento) de compostos que se encontram em solução, pode ser feita
através da espectrofotometria de ultravioleta e visível (UV-Vis), utilizando a lei empírica de Beer-Lambert. Esta lei
relaciona a concentração de um composto em solução, c (mol dm-3), com a sua absorvância A:
3

Figura 4 - Espectros de moléculas biológicas com grande extensão de conjugação
, salientada na estrutura da clorofila a.
Apresentam vários máximos de absorvância
no vísivel, para além de absorvância no
UV, não mostrada.

A = lc

(5)

onde l é a distância percorrida pelo feixe de luz na solução (cm) e é uma constante chamada "absortividade
­1
3
­1
molar" (mol dm cm ), uma vez que tem um valor numérico igual ao da absorvância quando a concentração de
soluto é 1 mol dm­3, para uma espessura de 1 cm de solução.
O valor de absorvância de uma solução é a soma das absorvâncias de todos os seus componentes,
solvente e solutos, e também do recipiente em que se encontra. Para determinar a absorvância devida a um único
soluto, a determinado comprimento de onda, é necessário medir a absorvância da solução com e sem esse soluto
e subtrair os dois valores. A solução que contém tudo menos o soluto de interesse designa-se "branco".
É importante que as amostras sejam soluções verdadeiras, límpidas, para que a medição do
espectrofotómetro seja puramente um resultado de absorção electrónica. Suspensões, colóides ou outras misturas
não homogéneas translúcidas contêm partículas que para além de absorverem radiação também a dispersam por
reflecção na sua superfície. Essa luz não foi absorvida mas é contabilizada como tal pelo espectrofotómetro.
Mesmo a luz que é absorvida não o é nas condições supostas de diluição do soluto, uma vez que este está
agregado em partículas em que muitas moléculas interagem só entre si e não com o solvente.

Figura 5 - Para medições espectrofotométricas de soluções
é usado um tubo de secção quadrada chamado "cuvete",
transparente às radiações ultravioleta (UV) e visível, ou só à
radiação visível. É medida a relação entre a quantidade de
luz que entra e que sai da amostra para determinar a sua
absorbância. Esta, segundo a lei de Beer-Lambert, é proporcional à espessura e à concentração c da amostra.

4

Figura 6 - Esquema de um espectrofotómetro.
D

F

C

H

E
A

I
B
D
G

H

A - Fonte de Radiação
B - Prisma
C - Fenda
D - Espelhos
E - Espelho divisor da radiação
F - Recipiente do "Branco"
G - Recipiente da Amostra
H - Detectores
I - Registador ou Computador

Instrumentação espectrofotométrica
Os espectrofotómetros de UV-Vis são constituídos pelas unidades básicas representadas na figura 6.
A fonte emissora de luz pode ser uma lâmpada de tungsténio que emite radiação em todo o intervalo de comprimentos de onda visível (325 nm < < 1000 nm), ou uma lâmpada de deutério (200 nm < < 360 nm)
para a região do ultravioleta. O selector de comprimento de onda, ou monocromador, inclui normalmente um
dispositivo difractor ou refractor de radiação, para separar a radiação da lâmpada por comprimentos de onda,
uma fenda para seleccionar a radiação de comprimento de onda desejado e ainda filtros para cortar radiações
interferentes. A luz incide na amostra e no "branco", que se encontram em tubos especiais chamados cuvetes
(figura 5). Estes tubos são de secção conhecida, construidos em quartzo ou plástico para medições na região UV
e visível, ou em vidro se a observação pretendida for só na região do visível. O detector é uma célula fotoeléctrica
que transforma a quantidade de luz emergente da amostra e do "branco" numa corrente eléctrica proporcional.
O esquema apresentado na figura 6 refere-se aos designados "espectrofotómetros de feixe duplo" em
que o feixe original é dividido em dois por um espelho rotativo ou por um prisma, passando um desses feixes
pela amostra e o outro pelo "branco". A diferença entre os espectros da amostra e do "branco" é feita
automaticamente e em tempo real pelo espectrofotómetro. Consegue-se assim a possibilidade de fazer varrimentos
de comprimentos de onda sem ter necessidade de trocar cuvetes entre a amostra e o "branco" para cada novo
comprimento de onda. No entanto, muitos espectrofotómetros são de feixe simples por que são mais baratos e se
adequam a análises quantitativas a um só comprimento de onda, em vez de análises qualitativas espectrais. Nesse
caso, antes de ser feita qualquer leitura de amostras coloca-se a cuvette do "branco" no espectrofotómetro,
selecciona-se o comprimento de onda desejado e define-se manualmente a absorvância do "branco" como zero.
Nas leituras subsequentes de amostras, o espectrofotómetro desconta automaticamente a absorvância do "branco"
e apresenta absorvâncias que se referem apenas às substâncias que se encontram nas amostras e que não se
encontravam no "branco".
Os espectrofotómetros de feixe simples com capacidade digital também podem ser usados para a
obtenção de espectros. O processo implica adquirir e guardar o espectro do "branco" dentro de um intervalo de
comprimentos de onda. Esse espectro pode depois ser subtraído ao da amostra, para o mesmo intervalo de
comprimentos de onda, obtendo-se como resultado apenas o espectro do soluto de interesse.
Os espectros de absorção UV-Vis como os da figura 4 são em geral gráficos que relacionam a absorvância
com o comprimento de onda. Deve ser notado, no entanto, que de acordo com a equação 5 a variação de
absorvância observada num rastreio de comprimentos de onda corresponde de facto à variação da absortividade
molar do soluto analisado em função do comprimento de onda, uma vez que a concentração c e o comprimento l
são constantes durante o rastreio.

5

y = -0.0852 + 0.9232 x
corr: 0.9896

Figura 7 - Recta de calibração. Os pontos representam as leituras de absorvância para soluções de
concentração conhecida, os padrões. A recta é obtida por regressão e deve passar muito perto do ponto
(0,0), conforme A = l c, se o branco for correctamente ajustado para absorvância zero. O declive da
recta de regressão é uma determinação experimental de
l . Estas rectas são válidas apenas para o comprimento de onda usado nas determinações e para o
intervalo de concentrações definido pelos padrões. A
relação A = l c aplica-se tanto melhor aos dados
experimentais quanto menor for a concentração c das
soluções. O coeficiente de correlação da regressão
linear é uma medida da precisão experimental.

Análise qualitativa
Muitos compostos biológicos absorvem luz no ultravioleta ou no visível. Estes compostos originam
espectros de absorção característicos para um dado conjunto de condições. Cada espectro fornece informações
não só respeitantes às ligações em que ocorre a promoção de electrões mas também relativamente à estrutura global
do composto. No entanto, a baixa resolução destes espectros faz com que não sejam muito úteis para a análise
estrutural de compostos complexos.
Análise quantitativa
Em Química, Bioquímica, Biologia Molecular e outras áreas científicas utiliza-se frequentemente a
espectrofotometria no doseamento de vários tipos de compostos biológicos, usando a já referida lei de BeerLambert e recorrendo normalmente ao uso de uma recta padrão. Para tal prepara-se uma série de soluções de
concentrações conhecidas da substância em análise e lêem-se as respectivas absorvâncias no espectrofotómetro ao
comprimento de onda a que essa substância apresenta maior absortividade molar. A partir destes valores é
construida a recta padrão, como se exemplifica na figura 7. Esta prática permite assegurar que a linearidade
esperada se observa de facto para o intervalo de concentrações pretendido. Tem ainda a vantagem de reduzir
drasticamente os erros de extrapolação. Como as soluções padrão e as leituras de absorvância têm sempre erros
experimentais inevitáveis, o uso de um único padrão, por exemplo, iria introduzir erros de extrapolação intoleráveis
para amostras com absorvância diferente da do padrão (figura 8).
Figura 8 - Erros de extrapolação. Esta simulação mostra
como a incerteza associada a um padrão se propaga e aumenta com o afastamento entre a concentração do padrão e
da amostra. Assume-se que o ponto (0,0) não tem incerteza o que na prática não é verdade uma vez que o "branco"
também é experimental e tem uma incerteza associada. Neste
caso, o erro de extrapolação pode diminuir mas o erro de
interpolação entre 0 e Cpadrão aumenta.

6

Figura 9 - Representação da cadeia dupla anti-paralela do DNA biológico. Esta conformação, bem como os comprimentos de ligação,
não são realistas, apenas servem para ilustrar a forma mais vulgar de interacção entre os nucleótidos num ácido nucleico de cadeia dupla.
O-

OO

P

O

P

O

O

H

H
H

H

H
H

O

P
O

O

H

N

A

H

H

H
H

O

N

N

N

A

H

N

H
H

H

H

O
H
O
O
N

N
O

T

N

H

H

N

N

T

N
O

G

H

O

O
H

H

H
H

H

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A

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-O

P
-O

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C
H

H
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P

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H

G

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H

H
H

H

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N

H

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N

N

H

N

T

O

CH3

H

N

CH3

O

N

CH3

H

O

N

C

H

N

H
O

N

N

H

N

N

O

H

N

H
H

H

N
H

N

O

H

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H
N

O

-O
O
H

H

O
H

H

N

H

O

O
O

H

O

H

P

O

H

O

O

-O
O-

P

O

O

H

H
O

O
O

O

O
O

P
O-

H

O

O
-O

O

P
O

-O

Para se saber qual é o comprimento de onda para o qual a substância a quantificar tem maior absortividade
molar pode fazer-se um varrimento ou rastreio (scan) da solução num intervalo de comprimentos de onda e
escolher aquele que apresentar maior valor de absorvância. É necessário ter em conta que a lei de Beer-Lambert só
é válida para um intervalo de valores de concentração, variável de composto para composto, e por isso apenas
deve ser utilizada no intervalo em que se verifica a linearidade.

Estrutura do DNA
O DNA biológico é constituído por duas cadeias lineares de desoxirribonucleótidos ligados covalentemente (figura 9). As duas cadeias estão extensamente associadas por conjuntos estereoespecíficos de pontes de
hidrogénio entre as bases. A molécula adopta uma conformação helicoidal em água devido ao facto das bases
azotadas que fazem parte dos nucleótidos serem fundamentalmente hidrofóbicas. A conformação helicoidal mantém a parte hidrofílica da molécula, desoxirribose e fosfato, no exterior, em extensa interacção com a água, enquanto que a parte hidrofóbica, formada pelas bases, fica afastada da água (figura 10). As bases empilham no interior
da hélice devido ao efeito hidrofóbico e a alguma interacção entre si do tipo van der Walls. Nos eucariotas, a
cadeia dupla espiral de DNA espiraliza-se em torno de proteínas chamadas histonas e superespiraliza para formar
os cromossomas.
Figura 10 - Representações dos
aspectos fundamentais da conformação nativa do DNA nas células.
A espiralização (em cima) é a conformação que, em água, faz com
que as bases hidrofóbicas
interactuem entre si por
empilhamento e não estejam tão expostas à água. A organização em
cromossomas (ao lado) depende
da presença das proteínas histonas
(esferas amarelas) e é exclusiva das
células eucarióticas.

7

Figura 11 - A variação da absorvância de soluções de DNA com a temperatura dá-se entre um mínimo, em que todos os nucleótidos
estão emparelhados, e um máximo, em que todos estão desemparelhados. À temperatura de fusão, Tm, metade dos nucleótidos estão
desemparelhados (esquerda). Se após a desnaturação por aquecimento de uma solução de DNA a deixarmos arrefecer, a absorvância
diminui devido à reassociação das cadeias (direita). Quando se trata de cadeias de DNA natural com milhares de nucleótidos, a
renaturação não é completa, por improbabilidade de reassociação de todos os pares de bases, e a absorvância não volta ao valor que
tinha antes da desnaturação. A este fenómeno chama-se "histerese de reassociação".

Aplicações da espectrofotometria de UV ao estudo de soluções de DNA
Todos os ácidos nucleicos exibem um máximo de absortividade molar a 260 nm, o que permite fazer
estudos quantitativos ou semi-quantitativos específicos. Um exemplo tem a ver com a determinação da contaminação de uma solução de DNA com proteínas. As proteínas têm absortividades máximas a 230 nm e 280 nm e o
rácio A260 / A280 de uma solução pura de DNA é de cerca de 1,9. Qualquer valor inferior a este indica uma
possivel contaminação da solução de DNA com proteínas pois estas vão contribuir para a absorvância a 280 nm
e não a 260 nm. A absorvância a 260 nm é usada para quantificar a concentração em DNA, mediante a
construção de uma recta padrão baseada na lei de Beer-Lambert (equação 5). A região linear da relação entre
absorvância e concentração para os ácidos nucleicos situa-se abaixo do valor 1 para a absorvância.
A absorvância dos ácidos nucleicos em cadeia dupla aumenta quando se desfazem as ligações por
ponte de hidrogénio entre cadeias. Este aumento de absortividade a 260 nm é designado por "efeito hipercrómico"
e tem origem numa alteração da configuração das orbitais moleculares quando as pontes de hidrogénio não existem.
O efeito hipercrómico exprime-se normalmente em percentagem usando a equação 6.
% efeito hipercrómico do DNA = 100 x (A260 (desnaturado) ­ A260 (nativo)) / A260 (nativo)

(6)

Estudo da desnaturação do DNA por UV
A desorganização da cadeia dupla do DNA pode ser alcançada de várias formas, entre as quais se
conta o aquecimento. O aquecimento não é mais do que uma transferência de energia de natureza tal que o sistema
receptor o armazena nos seus modos rotacionais, vibracionais e translacionais moleculares. Como alguns destes
modos de maior energia são incompatíveis com as conformações moleculares presentes antes do aquecimento,
algumas moléculas mudam de conformação e um novo equilíbrio entre estados conformacionais é atingido.
Uma forma de seguir as alterações conformacionais na molécula de DNA, nomeadamente a desassociação
das cadeias, é usar o efeito hipercrómico a 260 nm. A figura 11 mostra gráficos exemplificativos do aumento da
absorvância de uma solução de DNA com o aumento da temperatura. A temperatura para a qual metade dos
nucleótidos estão desemparelhados é chamada a "temperatura de fusão", Tm , do DNA e depende do seu
8

Figura 12 - Alternância entre cadeias duplas e simples necessária à replicação in
vitro do DNA. Esta alternância é provocada pela alternância da temperatura da
solução. Por cada alteração da temperatura a quantidade de DNA replicado
n
duplica. Isto implica uma amplificação de 2 em que n é o número de variações de
temperatura.

tamanho e do seu conteúdo em nucleótidos. Maior tamanho implica mais pontes de hidrogénio e portanto maior
quantidade de energia para as quebrar e logo maior temperatura de fusão. Já a dependência entre a temperatura
de fusão e o conteúdo em nucleótidos prende-se com o facto dos pares GC formarem três pontes de hidrogénio
enquanto que os pares AT formam apenas dois. Um conteúdo maior em pares GC implica assim mais pontes de
hidrogénio por par de nucleótido e logo uma temperatura de fusão maior.
Há outros factores, para além do tamanho e do conteúdo em pares GC, que intervêm na temperatura de
fusão do DNA. No protocolo laboratorial apresentado mais à frente estão previstas experiências que permitem
observar o efeito da concentração de NaCl na desnaturação do DNA. A presença de catiões na solução de
DNA estabiliza a sua conformação em cadeia dupla, por neutralizar algumas das cargas negativas existentes nos
grupos fosfato, que são ácidos (figura 9). As amostras de DNA nas soluções mais concentradas em NaCl devem
apresentar maior temperatura de fusão, por ser esperada maior estabilidade da conformação em cadeia dupla.

PCR e " primers"
Os oligómeros, ou oligonucleótidos, são pequenas cadeias de DNA com algumas unidades ou poucas
dezenas de pares de nucleótidos. Estes ácidos nucleicos são importantes para a técnica conhecida como "polimerase chain reaction" (PCR) porque são um requisito indispensável à associação da enzima DNA polimerase ao
DNA de onde se pretende replicar um determinado gene. Estes oligómeros, também chamados "primers", são
sintetizados com uma determinada sequência para que se associem ao DNA em locais específicos para a promoção da replicação de certos genes. Esta replicação é catalisada pela DNA polimerase, que só se associa ao DNA
nas zonas onde os primers estão ligados (figura 12). A PCR baseia-se na alternância de temperatura da solução
entre temperatura baixa, para a associação do "primer" e da DNA polimerase ao DNA, e temperatura alta, para
a desassociação das cadeias recém-formadas. Para que a PCR seja eficaz é portanto importante conhecer certos
parâmetros do primer, como a sua temperatura de fusão e as suas características de associação.
Equilíbrio de auto-associação de um oligómero auto-complementar seguido por UV
No Procedimento experimental é descrito um método que permite caracterizar o comportamento com a
temperatura de um oligonucleótido auto-complementar. Para isso é registada a absorvância de uma solução micromolar
do oligonucleótido a várias temperaturas. O modelo mais simples que pode descrever este fenómeno baseia-se no

9

princípio de que só há duas possibilidades para cada duas cadeias de oligonucleótidos: completamente emparelhadas ou completamente desemparelhadas. Este modelo de "tudo-ou-nada" não é válido para cadeias macromoleculares de DNA mas é válido para oligonucleótidos pequenos para os quais não se verifica a histerese de
reassociação. A reacção que traduz este modelo é a equação 7:
2C

C2

(7)

onde C simboliza uma cadeia desemparelhada de oligonucleótido e C2 uma cadeia dupla. A constante de equilíbrio e o balanço material para a reacção 7 são definidos pelas equações 8 e 9:

K = [C2]eq / [C]2eq
[C]total = 2[C2]eq + [C]eq

(8)
(9)

onde [C]total é a concentração total, conhecida, em cadeias de oligómero, emparelhadas ou não. É possível também
escrever uma expressão para absorvância observada, uma vez que esta é a média pesada das absorvâncias das
cadeias emparelhadas, Amin, e desemparelhadas, Amax:

A = (2 Amin [C2]eq + Amax [C]eq) / [C]total

(10)

Através de algumas substituições entre as equações 8, 9 e 10 é possível deduzir uma expressão para a constante
de equilíbrio em função das absorvâncias:
(A ­ Amax) / (Amin ­ Amax)
K = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­
2 [C]total ((A ­ Amin) / (Amax ­ Amin))2

(11)

Para se obter uma expressão que relaciona a absorvância com a temperatura é agora necessário utilizar as expressões que relacionam K com a temperatura, dadas pela Termodinâmica:
G 0 = H 0 ­ T S 0 = ­ RT ln K

(12)

Manipulando o segundo e terceiro membro da equação 12 obtém-se a expressão

T = H 0 / (­R ln K + S 0)

(13)

Substituindo a expressão 11 em 13 obtém-se uma função em que as variáveis relacionadas são a temperatura e a
absorvância, como se pretendia:
(A ­ Amax) / (Amin ­ Amax)
T = H 0 / (­R ln ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ + S 0)
2 [C]total ((A ­ Amin) / (Amax ­ Amin))2

(14)

Esta função 14 é a expressão quantitativa do modelo químico e termodinâmico que se pretende que
descreva os dados experimentais na forma temperatura/absorvância, e a sua aplicação é válida se se verificarem na
10

prática todas as hipóteses que foram postas para a sua dedução, nomeadamente, que cada molécula de oligonucleótido
ou está completamente livre ou completamente associada a outra. Esta é a hipótese tudo-ou-nada na base da
equação 7. É assumido também que os valores de H 0 e de S 0 não variam significativamente dentro do
intervalo de temperaturas dos dados experimentais.
A função 14 tem sempre uma forma gráfica sigmoidal (semelhante à letra "S"), dado o modo como
relaciona algebricamente as variáveis absorvância A e temperatura T , mas o tamanho e a localização gráfica do
sigmoide será diferente conforme os valores das constantes H 0, S 0, Amax, Amin e [C]total. Estas constantes,
chamadas parâmetros, são características do composto cuja associação se está a estudar. Cada oligonucleótido,
por exemplo, dependendo do seu tamanho, sequência e conteúdo em nucleótidos tem os seus valores específicos
0
0
dos parâmetros termodinâmicos H e S , e dos parâmetros espectrofotométricos Amax e Amin. Todos estes
parâmetros são também uma função da força iónica. O valor do parâmetro concentração, [C]total, é normalmente
conhecido à partida.
Uma outra forma da função 12 é
ln K = (­ H 0/R ) (1/T ) + S 0/R

(15)

Esta função tem a vantagem, relativamente à função 14, de ser linear para as variáveis ln K e 1/T . No entanto
exige que sejam pré-determinados os valores de Amax e Amin, em experiências nos limites de alta e de baixa
temperatura, respectivamente. Estes parâmetros, juntamente com a variável A, permitem calcular K pelo que a
expressão 15 fica apenas com dois parâmetros a determinar: H 0 e S 0.
O modo de determinar os valores dos parâmetros de uma função modelo é obter valores experimentais
para as suas variáveis e depois encontrar, usando, por exemplo, aproximações sucessivas, os valores dos parâmetros que melhor permitem ajustar os valores da função a esses valores experimentais. Esta técnica é conhecida como
regressão. O exemplo mais vulgar de regressão é a regressão linear, onde a função a ajustar às variáveis experimentais descreve graficamente uma recta. A expressão geral da relação linear entre variáveis é y = a + bx, onde x e
y são as variáveis e a e b são parâmetros. Os exemplos de funções modelo lineares são inúmeros, como a lei de
Beer-Lambert (equação 5) onde A e c são as variáveis e e l são os parâmetros. A equação 15 é outro
exemplo, já discutido acima. O método de determinação dos parâmetros varia consoante a função modelo é linear
ou não mas o critério de ajuste é normalmente o dos mínimos quadrados. Para uma função modelo geral y = f (x,
a, b, c, ...), onde x e y são as variáveis e a, b, c, etc, são os parâmetros, procuram-se os valores destes que
minimizam a função soma S do quadrado das diferenças entre os valores da função modelo y i = f (x i, a, b, c, ...)
e os valores y i,exp obtidos experimentalmente (variável dependente), para os mesmos valores x i (variável independente):

S = i (yi ­ yi,exp)2

(16)

Um exemplo concreto do resultado do ajuste da função 14 a valores experimentais é apresentado na
figura 12. As unidades de H 0 e de S 0 são derivadas das unidades usadas para a constante R. Na prática
laboratorial a temperatura é a variável independente (aquela que se escolhe) e a absorvância será a variável
dependente (aquela que se mede). Para efeito do método de regressão, no entanto, é irrelevante que a equação
14 não esteja resolvida em ordem à variável experimentalmente dependente, A, algo que até não é fácil de
conseguir. Como para todas as regressões, também é irrelevante a ordem pela qual se obtêm experimentalmente os
pares de valores (T ,A). É de notar que estes pares não correspondem a nenhum processo em particular mas sim
a estados de equilíbrio independentes e isso mesmo está explícito na dedução da equação 14. Esta equação foi
11

Figura 13 - Exemplo do resultado da regressão da função 14 sobre os valores experimentais da tabela incluída à direita no gráfico,
obtida por um grupo de alunos. A função 14 (linha a vermelho) que melhor se ajusta aos pontos experimentais (circunferências a
preto) é a que contém os valores de parâmetros que estão na tabela do lado esquerdo do gráfico. Verifica-se que a função se ajusta
bem à globalidade dos pontos, embora se afaste um pouco em duas zonas. Como os erros aleatórios são pequenos, isto pode ser
interpretado como resultado de um erro experimental sistemático ou como resultado da não completa verificação material das
hipóteses postas para a dedução da função modelo.
0.66
Data: A20100324G4_T
Model: Sigdna

0.62

Chi^2 = 0.75468
Amax 0.6432
±0.00065
Amin 0.51
±0
dH0
-196264.40211 ±3760.36853
dS0
-539.58003
±12.59776
c0
4.85E-6
±0

Abs

0.60

86
74
48
74
82
30
35
13
11
8
24
32
243
71
s1
b
66
55
55
66
66
55
66
5
.
.
A
-0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0
0.
0.
0.
0.
5
)- 555 555 555 555 551
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
0
5
6
3
8
9
6
1
2
9
4
2
7
0
3
(9
0
2
9
0
2
9
1
3
9
1
0
1
2
2
T2
3
3
2
3
3
2
3
3
2
3
3
3
3
3

0.64

0.58

0.56

0.54

0.52

0.50
270

280

290

300

310

320

330

340

T (K)

deduzida com base na equação química 7 e por isso os parâmetros obtidos por regressão da equação 14
correspondem à equação química 7, exactamente no sentido em que está expressa, independentemente da ordem
e do método pelos quais foram obtidos os valores experimentais (T ,A).
Considerando o modelo tudo-ou-nada da equação 7, define-se temperatura de fusão, Tm , como a
temperatura à qual metade das cadeias simples estão emparelhadas, o que se pode exprimir algebricamente pela
igualdade
2[C2]eq = [C]eq

(17)

A partir das equações 8, 9, 13 e 17 é trivial deduzir uma expressão para Tm em função de H 0, S 0 e [C]total,
expressão essa que não é mais do que um caso particular da equação 14 quando se verifica a equação 17.

Protocolo laboratorial
Material
Placa para agitação
Espectrofotómetro UV
Sensor de temperatura ou termómetro
Cuvete UV descartável com tampa
Parafilm
Flutuador para cuvete
Pipeta automática 1 ml

12

Papel absorvente
Banho de água a ferver
Gelo
Reagentes
­6
­3
Solução aprox. 5x10 mol dm (5 M) de um oligonucleótido autocomplementar de DNA com a
sequência 5'-ATATCGATAT-3' (Stabvida) em tampão PBS com concentração de NaCl 0,100 M
ou 0,154M
Solução tampão PBS (0,154 M em NaCl, 0,01M em fosfato de sódio, pH 7,4) ou
Solução tampão PBS (0,100 M em NaCl, 0,01M em fosfato de sódio, pH 7,4)
Procedimento
1 - a) Encaixe um tipe na pipeta automática e meça 1 ml da solução tampão PBS para uma cuvete UV
descartável. Anote a concentração de NaCl da sua solução PBS.
b) Informe-se junto do docente sobre qual o espectrofotómetro que deve utilizar e se está ajustado
para leituras a 260 nm.
c) Limpe bem a cuvete com um papel macio (elimine dedadas). Informe-se junto do docente sobre
a orientação correcta da cuvete e introduza-a no local apropriado no espectrofotómetro até bater no
fundo. Feche a tampa. A leitura aparece automaticamente no mostrador.
d) ANTES DE CARREGAR EM QUALQUER BOTÃO DO ESPECTROFOTÓMETRO
informe-se junto do docente sobre se já alguém o ajustou a zero de absorvância. Se não, ajuste a
absorvância a zero com a solução de PBS que introduziu no espectrofotómetro. Se sim, simplesmente anote a absorvância da sua solução de PBS (o valor obtido pode ser negativo porque depende
da cuvete). Este valor deverá ser subtraído posteriormente às leituras obtidas da amostra com
oligonucleótido.
2 - Peça ao docente que lhe forneça um microtubo contendo solução de oligonucleótido. Informe-se
sobre a sua concentração exacta em oligonucleótido e verifique que a concentração de NaCl desta
solução é a mesma da solução tampão PBS que usou no passo 1.
3 - Esvazie a cuvete da solução de PBS, escorra-a bem e transfira para o seu interior, com pipeta
automática, a totalidade (1 ml) de solução de oligonucleótido. Tape a cuvete com um pequeno
quadrado de Parafilm e encaixe uma tampa por cima. Fixe a tampa rodeando-a com mais Parafilm.
4 - Leia a absorvância da amostra à temperatura ambiente.
5 - Encha até meio a bacia de plástico com água fria da torneira e mergulhe o agitador magnético. Pouse
a bacia sobre o centro da placa e ligue a agitação, ajustando para uma velocidade moderada.
Mergulhe na água a ponta da sonda de temperatura.
6 - Insira a cuvete no flutuador até meio e pouse-o sobre a água dentro da bacia. Encoste-o à sonda de
temperatura para que não rode.
7 - Adicione gelo LENTAMENTE (para dar tempo a que o equilíbrio se vá ajustando) com a ajuda
da caneca de plástico até que a temperatura se situe entre os 4 e os 5 ºC.
8 - Aguarde 10 minutos mantendo a temperatura do banho estabilizada num valor à escolha entre 4 e
5 ºC.

13

9 - Anote a temperatura do banho e, RAPIDAMENTE, ...
a) Retire a cuvete do flutuador e leve-a para junto do espectrofotómetro.
b) Seque com papel absorvente, em duas passagens, as faces por onde deve passar o feixe de luz.
c) Introduza imediatamente a cuvete no espectrofotómetro e feche a tampa.
d) Leia o primeiro valor de absorvância apresentado logo após fechar a tampa.
e) Se a solução estiver abaixo dos 15 ºC repita rapidamente as alíneas b), c) e d) várias vezes e
aproveite a leitura mais baixa de todas.
NOTA: as repetições são necessárias dado que enquanto o banho estiver a menos de 15 ºC a
cuvete irá embaciar, o que compromete a leitura. À temperatura ambiente e a temperaturas superiores não é necessário fazer várias leituras. A temperaturas altas a rapidez de leitura é essencial e a
primeira leitura, se forem feitas várias, deve dar o valor mais alto, que é o pretendido.
10 - Reinsira a cuvete no flutuador e mergulhe-a na bacia. Com a caneca de plástico, adicione lentamente água quente à bacia (retire-a de um banho com água a ferver) de modo a que a temperatura suba
cerca de 3 ºC. Conserve a nova temperatura durante 5 minutos juntando gelo, água fria ou água
quente conforme necessário. NOTA: se a bacia contiver demasiada água retire alguma usando a
caneca.
11 - Repita os passos 9 e 10 até atingir uma temperatura entre 58 e 60 ºC.
12 - Quando terminar informe-se junto do docente sobre como proceder relativamente à limpeza e
arrumação da bancada e do material.

Tratamento e apresentação de resultados
NOTA: respeite as regras relacionadas com algarismos significativos.
1 - Peça ajuda ao docente para introduzir os seus dados experimentais no programa de computador
onde vai ser feita a regressão não-linear com base na função 14 da Introdução. Posteriormente, junte ao relatório
o gráfico e os resultados da regressão fornecidos pelo programa.
2 - Determine a expressão analítica que permite calcular a temperatura de fusão Tm do oligómero. Calcule
essa temperatura para os parâmetros obtidos no ponto 1.
3 - Anote os resultados obtidos pelos outros grupos da sua turma.
4 - Comente os resultados do seu grupo relativamente aos resultados obtidos pela turma, nomeadamente, para cada concentração de NaCl, a temperatura de fusão, os erros dos parâmetros, as médias de H 0 e de
S 0 e seus desvios padrão, os sinais de H 0 e de S 0, os seus valores de H 0 e de S 0 relativamente à
média, os valores de qui-quadrado para as regressões e as diferenças Absmax­Absmin observadas para o conjunto
de resultados. Discuta o efeito da concentração de NaCl sobre os valores obtidos.
NOTA: os parâmetros cujo valor se manteve fixo durante a regressão aparecem com um erro "±0" nos
resultados. Isso é natural para a concentração de oligonucleótido, que é conhecida. Por vezes, para facilitar a
convergência da regressão quando o conjunto de dados tem alguma falha, o docente pode bloquear o ajuste dos
parâmetros Amin ou Amax durante a regressão, ajustando-os manualmente, pelo que podem aparecer também
assinalados com um erro "±0".

14