Aplicações da Biotecnologia na
Agricultura
Cultura de Células e Tecidos
Anticorpos Monoclonais e Sondas de Ácidos Nucléicos para
diagnóstico
Engenharia genética de plantas para a introdução de novas
características
Mapeamento de genes
Genômica

Usos da Transformação de Plantas

A. Testar a função de genes ou partes de genes
B. Modificar a expressão de genes endógenos
- Desligar genes
- Aumentar a expressão
- Modificar a expressão
C. Mover genes entre organismos

Tecnologia Multidisciplinar
·Biologia Celular ­ cultura de tecidos
·Biologia Molecular ­ clonagem, estrutura e
função de genes
·Melhoramento ­ desenvolvimento e testes de
produtos
·Direito- temas regulatórios
·Marketing ­ aceitação pública

Requerimentos para produção de plantas
transformadas
A.

DNA a ser introduzido
1. gene marcador
2. promotor (constitutivo ou induzido),
região codificadora e sítio de poliadenilação

B.

Cultura de células e protocolo de regeneração

C.

Método de introdução do DNA na célula

D.

Prova da transformação da planta

Produção de Plantas Transgênicas

Isolar e clonar o gene de interesse
Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou
aumentar expressão do gene

Introduzir a construção gênica em células de
plantas (transformação)

Seleção de células ou tecidos transformados
Regeneração de plantas

Isolamento de genes
86 Genomas microbianos:
Archaea - 16 espécies
Bacteria - 70 espécies

42 Genomas de eucariontes:
Completos - 8 espécies
Em andamento - 35 espécies

Seqüenciamento de DNA

GENEBANK

incorporou
seqüências de mais de
105.000
organismos
Período de um ano - 4,6 milhões de
novas seqüências

Construíndo vetores:
genes, promotores, terminadores e marcadores

Enzimas de restrição
Nathaus, Smith, Arber 1971,

Engenharia Genética
Berg, Boyer, Cohen 1973

Estrutura molecular do
gene
Terminador

Região codificadora

Região promotora
Específicos

hnRNA

mRNA

CCAAT
TATA
Gerais

Gppp

Gppp

Exon

Exon

Exon

Intron

Exon

Exon

ORF

Translação

Exon

Poly A

Poly A

Construção de vetores para transformação
ACC oxi
Kpn I

SacI

HindIII

BamHI

pIBI 11

35S e + 35S pr

Hind III

SacI

ACC oxi

KpnI

EcoRI NcoI
35S polyA

BamHI

pIBI 21
35S
promoter

T-Border HindIII

ACC oxi

35S
35S
polyA promoter

EcoRI

pIBI 23

bar

35S
polyA

T-Border

Promotores mais comumente utilizados

Promotores constitutivos


CaMV 35S : expressão de genes exógenos em dicots.



Ubiquitin: promotor constitutivo em monocots.

Promotores Orgão/ tecido específico


Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes



-amilase: aleurona de cereais



Patatin: tubérculos de batata



RuBisCo: tecido clorofilado

Promotores induzidos e expressão transiente
Alguns transgenes têm impacto negativo; portanto transcrição somente
quando necessário.


Indução de macho-esterilidade para produção de híbridos



Genes de resistência a doenças quando patógeno aparecer



Atraso na expressão de genes quando interfere com
desenvolvimento inicial da planta

Induzido: alcool desidrogenase Etanol
Transiente: Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV)

FATORES INFLUENCIANDO A
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

Protocolo de cultura de tecidos
Fisiologia do explante
Método de introdução do DNA
Genes marcadores e indicadores
Protocolo de seleção

Cultura de Tecidos






Microprogação
Cultura de células
Variação somaclonal
Cultura de haplóides
Transformação

Sementes artificiais
Híbridos Interespecíficos
Resgate de embriões
Fusão de protoplastos

PROTOCOLOS DE CULTURA DE TECIDOS

Protoplastos
Calos
Meristemas
Brotos adventícios
Embriões somáticos

CULTURA DE CALOS

MERISTEMA

BROTOS ADVENTÍCIOS

BROTOS ADVENTÍCIOS (Citrus spp.)

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA (C. arabica)

MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM MÉTODOS
DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

·Reprodutibilidade
·Eficiência
·Rapidez
·Baixo custo
·Simplicidade
·Ampla aplicação

Transformação via vetor natural
Agrobacterium

tumefaciens
rhizogenes

Agrobacterium
Bactéria de solo
Transferência natural
de DNA para plantas,
causando doença
Substituição de DNA
da bactéria (T-DNA)
por DNA de interesse
Agrobacterium
transferirá novo DNA

Agrobacterium tumefaciens

Transformação via vetor natural
Bactéria com o

Ti -plasmídio

Infecção de plantas feridas e transferência do
DNA para as células

Ti -plasmídio
(responsável pela virulência)

Indução pelo T-DNA de:
1 - crescimento independente de hormônios,
2 - síntese de opinas (compostos de carbono e N
dos quais a bactéria se alimenta

Planta com agrobactérias
vivendo em galhas

Transferência de DNA da Agrobacterium

Transformação via vetor natural

AGROBACTERIUM
Vantagens
Método bastante
conhecido e estudado

Eficiente

Plantas com limitado
número de transgenes

AGROBACTERIUM
Desvantagens

Genótipo-específico (plantabactéria)
Monocot X Dicot
Dependência do sistema de
regeneração

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA

PROTOPLASTO

Eletroporação
Transferência de DNA via química
Microinjeção

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA

ELETROPORAÇÃO
Vantagens
Rápido e eficiente
Grande controle das condições
experimentais

Desvantagens
Bio-Rad®

Necessidade de protoplastos
Custo equipamento

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA

MICROINJEÇÃO

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA

Parede Celular Intacta
Vácuo
Biobalística
Vortex (fibras)
Sonicação
Embebição de sementes
Eletroforese

Infiltração de DNA à vácuo

BIOBALÍSTICA

Antes

Tubo de aceleração
Disco de ruptura
Macrocarrier

PDS-1000/He
Bio-Rad

Partículas + DNA
Tela
Tecido vegetal

Depois

Parâmetros Físicos

Velocidade das partículas
Tipo de partícula
Propelente e vácuo
Precipitação do DNA

Parâmetros Biológicos

Fisiologia do explante
Tamanho e densidade das células
Parede celular
Osmolaridade

Vantagens
Diversos protocolos de cultura de tecidos
Não exige vetores especializados
Transformação de organelas
Rapidez e simplicidade

Desvantagens
Equipamento especializado
Integração múltipla de transgenes
Variabilidade do processo

Métodos utilizados para transformação

Peg + Eletrop.
7%

Outros
7%

Biolística
21%

Agrobacterium
65%

Seleção de Plantas Transgênicas

GENES MARCADORES E INDICADORES

Indicadores

Marcadores

-Glucuronidase
Luciferase
GFP
Antocianina
NPT II
bar - glufosinato
BXN - bromoxinil
EPSPS - glifosato
ALS - sulfonilureias, imidazolinonas

Identificação e seleção de explantes
Genes indicadores
gus A
- glucuronidase

gfp
proteína de
fluorescência verde

Genes marcadores

Imidazolinonas - AHAS

Genes marcadores

Glifosato - EPSPS

Explantes em meio seletivo

Crescimento e enraizamento

Transferência para solo em condições controladas

Aclimatação

Casa-de-vegetação