40°C
C

20°C
cC

Nanopartículas híbridas de sílica mesoporosas
Elizabete Correia Coutinho
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Bioengenharia e Nanossistemas
Orientadores: Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha
Prof. Doutor Carlos Miguel Calisto Baleizão

Júri
Presidente: Prof. Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca
Orientador: Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha
Vogal: Prof. Doutor José Manuel Gaspar Martinho

Dezembro de 2014

ii

Agradecimentos

Gostaria de agradecer aos meus orientadores, Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha e
Prof. Doutor Carlos Miguel Calisto Baleizão pela oportunidade que me deram de integrar dentro desta
equipa de bons profissionais, pelas importantes sugestões, apoio e acompanhamento.

Gostaria igualmente de agradecer à Doutora Tânia Ribeiro e a Ana Sofia Rodrigues por todos os
conselhos e disponibilidade para ouvir e esclarecer as dúvidas que foram surgindo ao longo do
trabalho.

Não posso deixar de agradecer aos meus colegas de laboratório por toda a ajuda, boa
disposição e amizade.

Aos meus amigos de Mestrado pelo apoio constante ao longo do curso, pela troca de ideias e
companheirismo.

Aos meus amigos de longa data por todos os momentos de descontração e convívio.

Finalmente, quero agradecer aos meus pais por toda a compreensão e ajuda ao longo do meu
percurso académico. À minha irmã agradeço a forma como sempre me incentivou a ultrapassar os
obstáculos que apareceram ao longo de todos estes anos de estudo.

iii

iv

Resumo

A redução dos efeitos secundários de um fármaco pode ser obtida se estes forem
eficazmente aplicados de forma controlada e no local necessário. Assim, são desejáveis sistemas
que melhorem o transporte do fármaco e a sua entrega nas células alvo, resultando num aumento da
eficácia do fármaco e uma diminuição da toxicidade nos tecidos saudáveis. As nanopartículas
ganharam importância na área da medicina devido ao facto de possuírem uma razão área/volume e
capacidade de reconhecimento de locais alvo após apropriada modificação.
Neste trabalho foram sintetizadas nanopartículas híbridas mesoporosas (MSNs) com uma
arquitectura de núcleo-coroa. O núcleo de sílica mesoporosa possui uma morfologia bem definida e
controlada sendo excelentes candidatos para a incorporação de moléculas. As MSNs são
caracterizadas por poros ordenados com diâmetros de 2-2,5 nm e volumes de poros acima de 1 mL /
g. A polimerização RAFT (Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) associada ao
método "grafting from" foi utilizada para o crescimento na coroa de um polímero biocompatível com
resposta à temperatura, alternando entre uma conformação colapsada ou expandida. Essa alteração
de conformação pode ser utilizada para controlar a saída das moléculas que estão dentro dos poros
das MSNs, proporcionando uma plataforma conveniente para a libertação controlada de fármacos. As
nanopartículas foram caracterizadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM) e dispersão
de luz dinâmica (DLS) obtendo-se diâmetros entre 140 e 220 nm e com formato esférico. Foi possível
provar com sucesso o conceito da libertação controlada de moléculas no interior das MSNs por
estimulação térmica da coroa polimérica. Estas nanoestruturas abrem novos caminhos no
desenvolvimento de novos sitemas de libertação controlada.

Palavras chave: nanopartículas de sílica mesoporosas, núcleo-coroa, libertação controlada,
funcionalização, RAFT.

v

vi

Abstract

A decrease in the side effects of a drug can be obtained if it is delivered in an effective and
timely manner to the needed location. Therefore, systems are needed to improve the transport of the
drug and the location of the target cells, resulting in an increase in drug efficiency and decreased
toxicity to healthy tissues. Nanoparticles have gained much importance in medicine due to the fact that
they have high area to volume ratio and after functionalization with ability to recognize target sites.
In this work, hybrid mesoporous silica nanoparticles (MSNs) were synthesized with a coreshell design. The mesoporous silica core has a well-defined morphology with poros that can
incorporate molecules. The MSNs are characterized by ordered pores with diameters arround 2-2.5
nm and volumes above 1 mL / g. RAFT polymerization (Reversible Addition-Fragmentation chain
Transfer) associated with the grafting from method were used to growth a biocompatible polymer with
temperature conformation dependence, between a collapsed or expanded conformation. This
conformational change can be used to control the release of molecules incorporated in the pores,
providing a convenient platform for controlled release of drugs. The nanoparticles were characterized
by transmission electron microscopy (TEM), and dynamic light scattering (DLS) to give diameters
between 140 and 220 nm and having a spherical shape. We also prove with success the release of
molecules from the MSNs pores through thermal stimulation of the polymeric shell. These
nanoparticles open new pathways in the development of new controlled release systems.

Keywords:

mesoporous

silica

nanoparticles,

core-shell

nanoparticles,

controlled

release,

functionalization, RAFT.

vii

viii

Índice
Agradecimentos ....................................................................................................................................... iii
Resumo ....................................................................................................................................................v
Abstract................................................................................................................................................... vii
Índice de Figuras ..................................................................................................................................... xi
Índice de Tabelas ................................................................................................................................... xv
Abreviaturas ......................................................................................................................................... xvii
1º Capítulo ­ Introdução .......................................................................................................................... 1
1.1. Nanopartículas ............................................................................................................................. 1
1.2. Nanopartículas de sílica ............................................................................................................... 2
1.3. Síntese de nanopartículas por Sol-Gel ........................................................................................ 3
1.3.1. Método de Stöber para a síntese de nanopartículas compactas .......................................... 3
1.3.2. Síntese de nanopartículas mesoporosas .............................................................................. 4
1.4. Nanopartículas Híbridas ............................................................................................................... 5
1.5. Modificação das nanopartículas ................................................................................................... 6
1.6. Polimerização Radicalar Controlada ............................................................................................ 8
1.6.1. Polimerização RAFT .............................................................................................................. 8
1.7. Sistemas de libertação controlada ............................................................................................. 11
1.7.1. Nanopartículas para libertação controlada.......................................................................... 11
1.7.2. Sistemas moleculares de libertação controlada .................................................................. 12
1.7.3. Sistemas poliméricos de libertação controlada ................................................................... 13
2º Capítulo - Nanopartículas desenvolvidas neste trabalho ................................................................. 15
3º Capítulo ­ Parte Experimental .......................................................................................................... 17
3.1. Materiais ..................................................................................................................................... 17
3.2. Métodos ...................................................................................................................................... 17
3.2.1. Síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (MSNs) ................................................ 17
3.2.2. Nanopartículas de sílica mesoporosas marcadas com PDI (MSN-PDI) ............................. 18
3.2.3. Funcionalização da superfície das MSNs com APTES (MSN-PDI-APTES) ....................... 18
3.2.4. Remoção do tensioativo ...................................................................................................... 18
3.2.5. Adição do agente RAFT (CTA) ........................................................................................... 19

ix

3.2.6. Polimerização por RAFT (MSN-POLI) ................................................................................ 20
3.2.7. Incorporação e libertação nas MSN-POLI........................................................................... 21
3.3. Equipamento .............................................................................................................................. 21
3.3.1.Centrífuga ............................................................................................................................. 21
3.3.2. Dispersão de luz dinâmica .................................................................................................. 21
3.3.3. Microscopia electrónica de transmissão ............................................................................. 22
3.3.4. Potencial Zeta ...................................................................................................................... 22
3.3.5. Espectroscopia de fluorescência ......................................................................................... 22
3.3.6. Espectroscopia UV/Vis ........................................................................................................ 22
4º Capítulo- Apresentação e discussão dos resultados ........................................................................ 23
4.1. Caracterização óptica das partículas ......................................................................................... 23
4.2. Determinação da concentração do agente RAFT por UV/Vis.................................................... 24
4.3.Caracterização das MSNs ........................................................................................................... 26
4.3.1. Nanopartículas de sílica mesoporosas ............................................................................... 26
4.3.2. Nanopartículas de sílica mesoporosas com revestimento polimérico ................................ 29
4.4. Determinação do potencial zeta ................................................................................................. 32
4.5. Incorporação e libertação de sulforodamina B nas MSN-POLI ................................................. 34
4.5.1. Incorporação de sulforodamina B nas MSN-POLI .............................................................. 34
4.5.2. Estudo da libertação controlada nas MSN-POLI ................................................................ 35
Conclusão .............................................................................................................................................. 42

x

Índice de Figuras

Figura 1 - Exemplos de nanopartículas orgânicas, inorgânicas e híbridas. ........................................... 1
Figura 2 - Estruturas mesoporosas de sílica mais comuns a) MCM-41, b)MCM-48, c)MCM-50 [7]. ..... 2
Figura 3 - Estrutura molecular de tetraetilortossilicato (TEOS)............................................................... 3
Figura 4 - Esquema das equações de formação de nanopartículas de sílica pela hidrólise (1) e
condensação (2) (3) de alcóxidos de sílicio. ................................................................................... 4
Figura 5 - Reacções de hidrólise e condensação do TEOS que ocorrem no método de Stöber. .......... 4
Figura 6 - Esquema da síntese de nanopartículas mesoporosas com tensioativo: a) agregados
micelares, b) condensação do percursor de sílica, c) remoção do tensioactivo [17]...................... 5
Figura 7 - Funcionalização da superfície de NPs de sílica, com diferentes grupos funcionais e
(bio)moléculas (imagem adaptada de [25]). .................................................................................... 6
Figura 8 - Introdução de grupos funcionais em diferentes regiões de MSNs: a) na superfície externa,
(b) nas entradas de poros, ou (c) dentro das paredes [26]. ............................................................ 7
Figura 9 - Esquema representativo da funcionalização da superfície um alcoxi-silano. ........................ 7
Figura 10 ­ Estrutura do Agente RAFT e diferentes tipos. ..................................................................... 8
Figura 11 ­ Esquema representativo do agente RAFT ancorado na superfície através do grupo R e do
grupo Z (imagem adaptada de [31]). ............................................................................................... 9
Figura 12 - Decomposição do iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN). ................................... 9
Figura 13 - Diferentes tipos de sistemas de entrega de fármacos (adaptada de [18]). ........................ 12
Figura 14 - Processos envolvidos na preparação das nanopartículas híbridas. .................................. 16
Figura 15 - Comportamento esperado do polímero termossensível quando é aplicada temperatura.. 16
Figura 16 - Esquema representativo do processo de modificação da superfície das MSNs com
APTES. .......................................................................................................................................... 18
Figura 17 - Representação esquemática da reacção das MSN-APTES com o agente RAFT. ............ 19
Figura 18 - Estrutura molecular dos monómeros oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e 2-(2-metil
ethoxi) etilmetacrilato (MEO2-MA). ................................................................................................ 20
Figura 19 - Espectro de absorção da solução de PDI em etanol utilizadas nas sínteses MSN-PDI 3a e
3b. .................................................................................................................................................. 23
Figura 20 - Comparação dos espectros normalizados de excitação (a tracejado, emi=560 nm) e
emissão (linhas continuas, exc=500 nm) para o PDI (vermelho) e MSN-PDI 7a (azul). O PDI
numa solução de etanol está apresentado por linhas tracejadas e as nanopartículas MSN-PDI 7a
numa dispersão de etanol por linhas contínuas. ........................................................................... 24
Figura 21 - Espectro de absorção do agente RAFT (a verde) e das MSNs com NH 2 na superfície (a
cinzento) da amostra MSNs 2a, em dioxano. ............................................................................... 25
Figura 22 ­ Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-2a
( A, escala 1000nm), MSN-3a (B, escala 500nm), MSN-3b (C, escala 200nm) e respectivo
histograma da distribuição dos diâmetros (à direita). ................................................................... 27

xi

Figura 23 - Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-5b
(A, escala 1000nm), MSN-7a (B, escala 500nm), MSN-7b (C, escala 200nm) e respectivo
histograma da distribuição dos diâmetros (à direita). ................................................................... 28
Figura 24 - Imagem obtida por TEM da amostra MSNs 3b (200nm) ampliada para uma escala de
100nm. ........................................................................................................................................... 29
Figura 25 - Imagens TEM de MSN-POLI 2a (A, 200nm), MSN-POLI 3a (B, 100nm), MSN-POLI 3b (C,
200nm), MSN-POLI 5b (D, 200nm), MSN-POLI 7a (E, 100nm) à esquerda e gráfico de DLS com
o aumento de temperatura (20 a 50ºC) à direita. .......................................................................... 31
Figura 26 - Imagem TEM de MSN-POLI 7b (à esquerda) e gráfico de DLS a diferentes temperaturas,
para o ciclo de aquecimento (20- 50ºC, a preto) e de arrefecimento (50 - 20ºC, a cinzento). ..... 32
Figura 27 - Potencial Zeta das amostras com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero
(MSN-POLI). .................................................................................................................................. 33
Figura 28 - Espectro de absorção da solução de SRB (A) e dos sobrenadantes (B). Sobrenadante 1
(azul), sobrenadante 2 (verde) e sobrenadante 3 (roxo) após a incorporação de SRB nas MSNPOLI e centrifugação. .................................................................................................................... 34
Figura 29 - Espectros de excitação (linhas a tracejado) e emissão (linhas continuas) da SRB a 20ºC
(vermelho) e 50ºC (azul), com emi = 620 nm e exc=520 nm. ................................................... 36
Figura 30 ­ Imagem representativa da preparação da amostra para a realização do estudo de
libertação. O tudo de diálise (A) é composto por uma membrana de celulose na base e a célula
de plástico (B) contem tampão fosfato (pH~7). ............................................................................. 36
Figura 31 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (verde) e a 50ºC (azul) ao longo
do tempo (A). Com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 50ºC
foram normalizadas as intensidades de fluorescência a 50ºC, obtendo-se a curva a vermelho (B).
As intensidades de fluorescência foram medidas ao emi = 585 nm e exc=565 nm. ................ 37
Figura 32 - Variações de intensidade de fluorescência obtidas para a SRB (azul) e MSN-SRB (verde),
alterando a temperatura de 50 para 20ºC, de 20 em 20 minutos (A). As intensidades de
fluorescência dos intervalos correspondentes a 50ºC para a SRB (vermelho) e para as MSNSRB (roxo) foram normalizadas com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC
com SRB a 20ºC (B). As intensidades de fluorescência foram medidas ao emi = 585 nm e
exc=565 nm. ................................................................................................................................ 38
Figura 33 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (vermelho) e MSN-SRB a 20ºC
(azul) e intensidades de fluorescência normalizadas obtidas para a SRB a 50ºC (verde) e MSNSRB a 50ºC (roxo) e respectivos ajustes para cada intervalo. As intensidades de fluorescência
foram medidas ao emi = 585 nm e exc=565 nm. ...................................................................... 39
Figura 34 - Representação dos declives obtidos através dos ajustes efectuados para as variações da
intensidade de fluorescência da SRB (amarelo) e MSN-SRB (laranja) a 50ºC e para SRB
(cinzento) e MSN-SRB (azul) a 20ºC. ........................................................................................... 40
Figura 35 - Esquema representativo do comportamento das MSN-POLI carregadas com a
sulforodamina B. O polímero a 50ºC encontra-se expandido (B e C) e a 50ºC colapsa (C e D) . A

xii

50ºC a SRB presente na coroa polimérica é libertada. Com a diminuição da temperatura, o
polímero encontra-se novamente expandido. ............................................................................... 41

xiii

xiv

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Comparação entre dois sistemas de entrega de fármaco, lipossoma e nanopartícula (+:
baixo; ++: moderado; +++: elevado) (adaptada de [18]). .............................................................. 13
Tabela 2 - Reagentes e quantidades utilizadas na modificação da superfície das nanopartículas de
sílica com agente RAFT. ............................................................................................................... 19
Tabela 3 - Razão molar, quantidade de RAFT e número de monómeros por cadeia utilizado em cada
polimerização................................................................................................................................. 20
Tabela 4 - Concentração da solução de PDI obtida a partir de medições de absorvância em etanol. 23
Tabela 5 - Concentração do agente RAFT na superfície das nanopartículas obtido a partir de
medições de absorvância em dioxano. ......................................................................................... 25
Tabela 6 - Diâmetro médio e desvio padrão de cada amostra de MSNs, obtido por DLS e TEM. ...... 26
Tabela 7 - Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de sílica a 25º C e nanopartículas híbridas de
resposta térmica em água a 25 e 40 º C, medida por DLS. .......................................................... 30
Tabela 8 - Potencial Zeta das amostras de MSNs com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com
polímero (MSN-POLI). ................................................................................................................... 33
Tabela 9 - Concentrações dos sobrenadantes na célula de quartzo e número de moles de SRB nos
sobrenadantes. .............................................................................................................................. 35
Tabela 10 - Número de moles de SRB usadas na incorporação, nos sobrenadantes e que ficaram nas
MSN-POLI 2a. ............................................................................................................................... 35

xv

xvi

Abreviaturas

AIBN

2,2 '-azobis (2-metilpropionitrilo)

APTES

3-aminopropiltrietoxisilano

CMC

Concentração micelar crítica

CRP

Polimerização Radicalar Controlada

CTA

Agente de Transferência de Cadeia

CTAB

Brometo de Cetiltrimetilamónio

DH

Diâmetro hidrodinâmico

DLS

Dispersão de luz dinâmica

DTEM

Diâmetro obtido por microscopia de transmissão electrónica

EDC

N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida

LCST

Temperatura de solução crítica inferior

MCM-41

Mobil Composition of Matter Number 41

MCM-48

Mobil Composition of Matter Number 48

MCM-50

Mobil Composition of Matter Number 50

MEO2MA

2-(2'metoxi-etoxi)etil metacrilato

MSNs

Nanopartículas de silíca mesoporosas

NPs

Nanopartículas

NaH2PO4

Fosfato monossódico

Na2HPO4

Fosfato dissódico

NaOH

Hidróxido de sódio

OEGMA

Oligo (Etileno glicol) metacrilato

PBS

Tampão fosfato

PDI

Bis(propil)trietoxisilanoperilenodiimida

PEG

Poli(Etileno Glicol)

RAFT

Transferência Reversível de Cadeia por Adição Fragmentação

SDS

Dodecil sulfato de sódio

SRB

Sulforodamina B

TEM

Microscópio Electrónico de Transmissão

xvii

TEOS

Tetraetilortossilicato

exc

Comprimento de onda de excitação

emi

Comprimento de onda de emissão



Coeficiente de absortividade molar

ZP

Potencial Zeta

xviii

1º Capítulo ­ Introdução
1.1.

Nanopartículas
A natureza hidrofóbica da maioria dos agentes quimioterapêuticos torna-os pouco solúveis em

água e, por conseguinte, limita a sua administração em doses elevadas. Assim, são requeridos
sistemas para melhorar o transporte do fármaco e a sua entrega nas células alvo. Desta forma,
obtém-se um aumento da eficácia do fármaco e uma diminuição da toxicidade nos tecidos saudáveis.
Estes conceitos continuam a ser uma prioridade na terapia do cancro [1].
As nanopartículas (NPs) têm despertado bastante interesse na área de medicina devido ao
facto de ser possível a resolução de vários desafios na área da nanobiotecnologia e da
nanomedicina. Por exemplo, estas estruturas podem ser usadas como sistemas de entrega
controlada de fármacos, pois conferem a protecção do fármaco de modo a evitar a degradação rápida
nos sistemas biológicos durante as terapias [2]. Uma das aplicações mais estudadas é no tratamento
do cancro numa fase inicial, para a detecção de células cancerígenas. Actualmente, o maior
problema no tratamento do cancro é os tratamentos destroem não só as células cancerígenas, mas
também as células saudáveis [3]. As principais características das NPs são: o tamanho, a
modificação da superfície e o rácio área/volume. O tamanho das nanopartículas (1 nm - 1000 nm)
permite que as nanopartículas possam atravessar as barreiras biológicas de forma a alcançar os
locais de destino, conseguindo assim penetrar nas células. A

estabilização das NPs contra a

agregação é um pré-requisito essencial na ciência de nanopartículas, para tal é necessário
funcionalizar com moléculas ligantes ou cadeia poliméricas [4].
A composição das NPs determina a compatibilidade e a adaptação para diferentes aplicações,
tais como entrega do fármaco, bioimagem, reconhecimento biomolecular, sensores, revestimentos.
Dependendo da composição das nanopartículas, estas podem ser caracterizadas como orgânicas
(agregados micelares, dendrímeros, vesículas, nanopartículas poliméricas), inorgânicas (NPs de
sílica, ouro, dióxido de titânio, dióxido de ferro, quantum dots) e híbridas, com dois ou mais
componentes na sua constituição, por exemplo, sílica ­ polímero (Figura 1) [5].

Si
NP Polímero

Lipossoma
NPs Orgânicas

Dendrímero

Sílica

Au
Quantum dot
NPs Inorgânicas

Ouro

Sílica e polímero
NPs Híbridas

Figura 1 - Exemplos de nanopartículas orgânicas, inorgânicas e híbridas.

1

1.2.

Nanopartículas de sílica
As nanopartículas de sílica possuem propriedades interessantes como a força mecânica, a

permeabilidade, a estabilidade térmica e química, baixo índice de refracção e elevada área
superficial. NPs de sílica podem ser modificadas para promover a sua bioconjugação com diferentes
moléculas.
Em 1992 foram desenvolvidos, pela Mobil Oil Corporation, materiais mesoporosos de sílica
com uma estrutura ordenada denominados por M41S. Estes materiais têm diâmetros na ordem dos
micrómetros e possuem poros cilíndricos e uniformes com diâmetros de poro entre 2 e 30 nm e
2

consequentemente, uma grande área superficial (700­1500 m /g). Rapidamente, estas estruturas
mesoporosas foram reconhecidas como uma descoberta bastante importante que poderia levar a
uma grande variedade de aplicações. Para produzir estas estruturas são utilizados tensioactivos que
servem de molde para criar poros. As estruturas mesoporosas que melhor representam esta classe
de materiais são os MCM-41 (Mobil Crystalline Materials), com um arranjo hexagonal dos mesoporos
e poros com formato cilíndrico (Figura 2 a), os MCM-48 (Figura 2 b) com um arranjo cúbico e os
MCM-50 que possuem uma estrutura laminar (figura 2c) [6] [7].

Figura 2 - Estruturas mesoporosas de sílica mais comuns a) MCM-41, b)MCM-48, c)MCM-50 [6].

A redução do tamanho é bastante importante para que estes materiais mesoporosos possam
ser utilizados para aplicações biomédicas como sistema de libertação de fármaco. Actualmente, é
possível obter nanopartículas de sílica mesoporosas com diâmetros de 40 a centenas de nanómetros.
As nanopartículas de sílica mesoporosa têm uma estrutura mesoporosa adaptável, com poros bem
definidos e volume de poro superior a 1 mL / g. Essa estrutura é uma propriedade bastante
importante e interessante visto que os mesoporos encontram-se especificamente alinhados e
estruturados de tal maneira que aparentam a forma de favos de mel. Os canais ou poros observados
funcionam como um reservatório individual sem ligações entre eles e a estrutura destes pode ser
controlada pelo tensioactivo. Estas nanopartículas são biocompatíveis e a rede tridimensional com
grupos silanol (Si-OH) dentro dos poros ou na superfície) e siloxano (Si-O-Si, no interior da rede),
atribuem características hidrofílicas às partículas que são estáveis tanto a nível químico como
térmico, têm morfologia controlável e

são simples de sintetizar. A fácil funcionalização da sílica

permite que este material seja ideal para uma combinação de diagnóstico e de terapia (teragnóstico)
[7] [8].
As vantagens únicas das estruturas mesoporosas de sílica são bastantes estudadas pois têm
a capacidade de bioconjugação com diferentes moléculas o que possibilita o uso destas como
2

sistemas de entrega de fármaco [9]. As nanopartículas de sílica mesoporosa têm sido especialmente
destacadas devido à capacidade de atravessar a membrana celular e à elevada eficácia na
incorporação de diversos agentes terapêuticos que serão libertados controladamente no local alvo
durante um período de tempo [10] [11].

1.3. Síntese de nanopartículas por Sol-Gel
Vários métodos de sol-gel têm sido desenvolvidos para controlar a morfologia e tamanho (601000 nm) das nanopartículas. Dependendo da variação de alguns parâmetros tais como pH,
temperatura, solventes, catalisadores e precursores podem ser produzidas diferentes nanopartículas.
O processo sol-gel tem sido bastante utilizado na preparação de materiais híbridos onde ocorre a
hidrólise de um percursor do tipo alcóxido de silício numa solução aquosa de etanol que leva à
formação de partículas. Os precursores de sílica mais comuns no processo sol-gel são os alcóxidos
de silício, sendo o mais utilizado o tetraetilortossilicato (TEOS) (Figura 3). Os catalisadores
frequentemente utilizados são o ácido clorídrico (HCl), ácido nítrico (HNO 3), ácido fluorídrico (HF),
ácido acético (CH3COOH) , hidróxido de sódio (NaOH) e hidróxido de amónio (NH4OH) [12] [13].

Figura 3 - Estrutura molecular de tetraetilortossilicato (TEOS).

1.3.1. Método de Stöber para a síntese de nanopartículas compactas
A síntese de nanopartículas de sílica foi realizada, pela primeira vez, por Stöber et al. [14],
obtendo partículas de sílica esféricas e monodispersas com diâmetros entre 30 nm e 2 µm, através
do controlo das quantidades dos reagentes utilizados. O método de Stöber consiste na hidrólise
(Figura 4 - 1) e condensação (Figura 4 ­ 2 e 3) de alcóxidos de sílicio em meio básico.

3

Si(OCH2CH3)4 + 4 H2O Si(OH)4 + 4CH3CH2OH

(1)

Si(OCH2CH3)4 + Si(OH) 4+3H2O (OH)3Si-O-Si(OH)3 +4CH3CH2OH

(2)

Si(OH)4 + Si(OH)4 (OH)3Si-O-Si(OH)3 + H2O

(3)

Figura 4 - Esquema das equações de formação de nanopartículas de sílica pela hidrólise (1) e
condensação (2) (3) de alcóxidos de sílicio.

As nanopartículas de sílica são produzidas por hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato
(TEOS) na presença de água, hidróxido de amónio e etanol. Após a hidrólise do TEOS, a reacção
prossegue com a condensação dos grupos hidroxilo (OH), que resulta na formação da rede de
ligações Si-O-Si [15]. Na Figura 5, está representado um esquema das reacções envolvidas neste
método de síntese.

Figura 5 - Reacções de hidrólise e condensação do TEOS que ocorrem no método de Stöber.

O crescente interesse em materiais híbridos gerou a necessidade da modificação
química da superfície das partículas de sílica, visando melhorar as interacções intermoleculares e
aumentando a biocompatibilidade. Os grupos hidroxilo na superfície das partículas de sílica
podem ser facilmente modificados com compostos orgânicos ou polímeros, desde que sejam
funcionalizados com agentes de acoplamento adequados.

1.3.2. Síntese de nanopartículas mesoporosas

A síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (Mesoporous Sílica Nanoparticles, MSNs)
requer um tensioactivo de forma a actuar como molde, um precursor de sílica e um catalisador. Os
tensioactivos possuem uma estrutura molecular anfifílica, ou seja, são constituídos por uma parte
hidrofóbica e uma parte hidrofílica. No processo de síntese, quando a concentração é superior à
concentração micelar crítica (CMC), o tensioactivo forma agregados moleculares que se associam
espontaneamente em solução formando uma variedade de estruturas, sendo as mais simples, a
esférica e a cilíndrica (Figura 6). Essas diferentes estruturas que as moléculas apresentam não
dependem só da concentração, mas também de diferentes parâmetros tais como: o comprimento das
4

cadeias hidrofílicas e hidrofóbicas, o pH, a temperatura. O precursor de sílica condensa nas cabeças
polares que constituem as micelas e após a remoção do tensioactivo são obtidas partículas com
mesoporosos disponíveis para a incorporação de moléculas. O tensioactivo pode ser removido por
calcinação ou extracção ácida [16]. O tamanho dos poros é influenciado pelo tensioativo utilizado.
Quanto maiores forem as estruturas formadas pelo tensioativo, maior o diâmetro das micelas e
consequentemente maior o tamanho dos poros [17].

a)

b)

c)

Figura 6 - Esquema da síntese de nanopartículas mesoporosas com tensioativo: a) agregados micelares,
b) condensação do percursor de sílica, c) remoção do tensioactivo [17].

Na última década, as nanopartículas de sílica têm vindo a mostrar grande importância no
desenvolvimento de novos materiais, visto que apresentam propriedades específicas como a área
superficial, o volume de poros e a possibilidade de incorporar moléculas orgânicas na rede de sílica
formando materiais híbridos [18].

1.4.

Nanopartículas Híbridas
Apesar dos benefícios que as nanopartículas têm prestado à medicina, algumas aplicações

continuam a ser um desafio, como por exemplo, na monitorização em tempo real dos processos
celulares, principalmente o local onde se dá a libertação do fármaco. A criação de nanopartículas
híbridas pode melhorar significativamente as características das NPs já existentes e superar este tipo
de desafios.
As nanopartículas de núcleo-coroa podem ser preparadas numa larga série de combinações
diferentes, inorgânico - inorgânico, inorgânico - orgânico, orgânico -inorgânico e orgânicos-orgânico.
A coroa e o núcleo podem ser compostos por sílica, metais, semicondutores ou polímeros. Exemplos
de tais materiais são a sílica-Au [19][20], sílica-PEG [9], PEG-sílica [21].
O material inorgânico, quando utilizado como revestimento de um material orgânico, por
exemplo, núcleo polimérico e coroa de sílica, é benéfico em vários aspectos, tais como o aumento da
resistência do material, resistência à oxidação, estabilidade térmica e resistência à abrasão. Também
metais como o ouro e a prata são utilizados para revestir o núcleo. As nanoparticulas podem ser
utilizadas em diferentes áreas de biotecnologia, imunodetecção e aplicações biomédicas [22].
Os materiais híbridos com núcleo de sílica e coroa de polímero podem ser obtidos por uma
simples mistura dos componentes orgânicos e inorgânicos. No entanto, a combinação de sílica e

5

polímero orgânico não é fácil de obter devido à incompatibilidade entre os dois componentes. Os
grupos hidrofílicos (grupos silanol) presentes na superfície das NPs formam ligações de hidrogénio
que conduzem à formação de agregados e na ausência de polímero os agregados de NPs de sílica
permanecem intactos afectando as propriedades funcionais das partículas. O revestimento orgânico
sobre o material inorgânico apresenta uma melhor biocompatibilidade e funciona como protector para
impedir qualquer influência da composição do núcleo sobre a mobilidade da partícula . Uma forma de
aumentar a compatibilidade entre o polímero e as NPs de sílica é a funcionalização da superfície da
sílica. O uso de agentes de acoplamento não só melhora a compatibilidade entre as fases orgânicas
e inorgânicas, mas também aumenta a interacção entre os componentes [23].
A incorporação de vários materiais numa estrutura oferece oportunidades para melhorar as
propriedades físicas e químicas, e adquirir mais funções numa única nanoestrutura [2]. Por exemplo,
corantes integrados na estrutura da sílica têm sido amplamente estudados para aplicações em
bioanálise, imagem e marcação devido à elevada estabilidade, boa biocompatibilidade e baixo custo.
Derivados de perilenodiimida (PDI) são exemplos de corantes que podem ser incorporados na rede
de sílica [9].

1.5. Modificação das nanopartículas
A presença de grupos silanol na superfície das nanopartículas permite a sua modificação com
grupos funcionais ou (bio)moléculas (Figura 7), tais como moléculas fluorescentes, agentes de
acoplamento e biomoléculas, quer por uma ligação covalente ou por adsorção [21]. A presença de
grupos reactivos (tais como amina, carboxilo ou hidroxilo) na superfície das partículas proporciona
locais activos para ligar outras moléculas. A elevada área de superfície, a versatilidade em ligar-se a
grupos funcionais e a biocompatibilidade faz das nanopartículas um dos nanomateriais mais
estudados como sistemas de entrega de fármacos [24].

Figura 7 - Funcionalização da superfície de NPs de sílica, com diferentes grupos funcionais e
(bio)moléculas (imagem adaptada de [24]).

6

A funcionalização das nanopartículas pode ocorrer em diferentes regiões da partícula
consoante o propósito. Na superfície externa das MSNs pode-se imobilizar polímeros ou
biomoléculas para possível direccionamento ou detecção. Para funcionalizar as MSNs somente na
superfície externa é necessário a presença do tensiativo que permite que os poros fiquem
bloqueados e não ocorra funcionalização no interior. Após a funcionalização o tensioativo poderá ser
removido ficando o poro disponível para incorporar diferentes moléculas (Figura 8) [25].

Figura 8 - Introdução de grupos funcionais em diferentes regiões de MSNs: a) na superfície externa, (b)
nas entradas de poros, ou (c) dentro das paredes [25].

A modificação da superfície tem como finalidade o acoplamento de um agente modificador ou
realizar o "enxerto" de uma cadeia polimérica. O agente modificador é constituído por grupos silano e
pode ser representado por RSi(OR´)3, em que o grupo hidrolizável corresponde ao OR´ e o grupo R
dará a nova funcionalidade à superfície da nanopartícula [26]. Um exemplo de um agente modificador
é 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES). Ao utilizar este agente modificador, a superfície da
nanopartícula fica revestida de grupos amina. Na figura 9, está representada a composição inicial da
superfície da NP e a estrutura da partícula após modificação da superfície com o agente modificador.

Figura 9 - Esquema representativo da funcionalização da superfície um alcoxi-silano.

7

1.6. Polimerização Radicalar Controlada
A síntese de polímeros teve um grande progresso nos últimos 15 anos com o aparecimento
das técnicas de polimerização radicalar controlada (CRP). Estas técnicas atrairam muita atenção dos
químicos devido ao facto de ser uma poderosa ferramenta para sintetizar polímeros com estruturas
bem definidas [27]. Com esta técnica, tornou-se possível a obtenção de (co)polímeros com baixa
polidispersividade e com as mais diversas morfologias. Existem três géneros principais de CRP: a
Polimerização Radicalar por Transferência Atómica (atom transfer radical polymerization, ATRP), a
Polimerização Mediada por Nitróxido (Nitroxide-mediated polymerization, NMP) e a Transferência
Reversível de Cadeia por Adição Fragmentação (Reversible addition-fragmentation chain transfer,
RAFT) [28].

1.6.1. Polimerização RAFT
A técnica de polimerização por RAFT foi introduzida pelo grupo de Rizzardo no instituto
CSIRO, em 1998 [29]. A polimerização por RAFT é uma técnica versátil de polimerização radicalar
controlada que permite a síntese de uma grande variedade de macromoléculas com estruturas bem
definidas. O processo baseia-se numa reacção de adição-fragmentação reversível mediada por
compostos com grupos tiocarbonílo usados como agentes de transferência de cadeia (Chain Transfer
Agent, CTA). Este processo possui vantagens com a capacidade de controlar a polimerização de uma
ampla gama de monómeros; a compatibilidade com um grande número de condições experimentais
(por exemplo, em solução orgânica ou aquosa, emulsão, mini-emulsão, suspensão); e a fácil
implementação. O RAFT é uma técnica de polimerização controlada que na presença de agentes de
transferência de cadeia (CTA) faz com que as cadeias poliméricas cresçam de maneira similar [30].
No processo RAFT, o CTA que desactiva de forma reversível a propagação de radicais é conhecido
como agente RAFT (Figura 10). Geralmente, um agente RAFT tem grupos tritiocarbonato ou
ditioester, com substituintes R e Z que têm de ser seleccionadas de acordo com os monómeros a
polimerizar e condições de reacção. O Z corresponde a um grupo estabilizante e R, um grupo de
saída. Os grupos estabilizantes e de saída irão influenciar o grau de controle da polimerização e a
cinética da reacção. A selecção do agente de transferência de cadeia é crucial nestes sistemas uma
vez que a sua natureza influencia a arquitectura molecular dos polímeros [25].
Estrutura

Grupo estabilizante (Z)
-R

Ditioéster

-S-R

Tritiocarbonato
(tritioéster)

Figura 10 ­ Estrutura do Agente RAFT e diferentes tipos.

8

Para o grafting das cadeias de polímero na nanopartícula de sílica são utilizados dois métodos:
grafting to e grafting from. No método grafting to as cadeias poliméricas que transportam grupos
reactivos nas cadeias laterais ou terminais são acoplados de forma covalente à superfície. O método
grafting from utiliza as espécies activas existentes nas superfícies de materiais para iniciar a
polimerização de monómeros a partir da superfície. Este método dá origem a um revestimento
polimérico com uma maior densidade de grafting [31]. Para ocorrer a polimerização em
nanopartículas é necessário modificar a superfície com um agente de acoplamento. O agente de
acoplamento ou agente RAFT pode ser ancorado a uma superfície inorgânica pelo grupo R ou pelo
grupo Z. No caso do agente RAFT estiver ligado à superfície da partícula pelo grupo R, as cadeias
poliméricas podem crescer facilmente a partir da superfície desde que haja difusão de pequenas
moléculas de monómero. Se o agente RAFT estiver ligado à superfície inorgânica pelo grupo Z, a
propagação vai ocorrer em solução com o controlo do agente de transferência de cadeia a partir da
superfície inorgânica [32]. A figura 11 mostra como o agente RAFT pode ser estar ligado à superfície
através deste dois métodos.

Figura 11 ­ Esquema representativo do agente RAFT ancorado na superfície através do grupo R e do
grupo Z (imagem adaptada de [32]).

As reacções em cadeia são caracterizadas por três etapas com diferentes cinéticas: iniciação,
propagação e terminação. Inicialmente ocorre a decomposição do iniciador, gerando radicais. Por
exemplo, o iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN), pode ser decomposto termicamente ou
por irradiação UV para a produção de radicais livres, que são moléculas que contêm átomos com
electrões desemparelhados. A decomposição do iniciador AIBN está apresentada na figura 12.

Figura 12 - Decomposição do iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN).

9

Esta decomposição origina uma molécula de azoto e dois radicais.
I

2R*

Esses radicais vão reagir radicalmente com unidades de monómero, formando radicais de
propagação.
R*+M

Pm*

Os radicais gerados durante a iniciação (Pm*) reagem com o agente RAFT, ao ligar-se à dupla
ligação do enxofre (1) formando assim um radicalar intermediário (2). Esse intermediário é
decomposto, originando um composto tiocarbonílico polimérico (3) e há libertação do grupo ligado
ao segundo enxofre, conhecido como grupo R.
Esta etapa é denominada de pré-equilibrio, onde kadd e k- são as constantes de adição
para a formação do radical intermediário e k-add e k são as constantes de fragmentação do radical
intermediário.

O novo radical (R*), que está activo, vai reagir com outras moléculas de monómeros livres e
criar um novo radical de propagação (Pn*). Ocorrendo, assim, a reiniciação.
R* + M

Pn*

Por fim, gera-se um equilíbrio nos radicais estabelecido entre
ativas (Pn*

e

as

espécies

propagantes

Pm*) e os compostos dormentes (3 e 5) permitindo igual probabilidade para o

crescimento de todas as cadeias poliméricas e, desta forma, a obtenção de cadeias poliméricas com
estreita distribuição de massas moleculares.

A cadeia propagante é desativada sem a formação de um novo centro ativo, terminando,
assim, o crescimento da macromolécula. Esta etapa denomina-se de terminação.
Pn* + Pm*

"Polímero morto"

10

Ou seja, na presença de espécies radicalares, o CTA induz reacções de transferência de
adição-fragmentação reversíveis para criar um equilíbrio entre as espécies activas (radicais de
propagação) e onde as chamadas espécies dormentes podem tornar-se ativas novamente. Este
equilíbrio é responsável pelo controlo da polimerização.
O peso molecular é influenciado por vários parâmetros como o iniciador e o agente de
transferência de cadeia. Se a quantidade de iniciador for elevada o número de radicais vai ser maior e
consequentemente haverá mais cadeias polímericas em torno da nanopartícula o que leva a que M w
seja menor. No caso de uma maior quantidade de CTA, obtém-se uma distribuição mais estreita do
peso molecular pois as cadeia poliméricas possuem comprimento idêntico sendo que a reacção é
mais controlada [33].

1.7.

Sistemas de libertação controlada

Os sistemas de libertação controlada, frequentemente descritos como Drug Delivery Systems
(DDS) possibilitam a libertação localizada do fármaco num local alvo e o controlo da taxa de
libertação, reduzindo assim a toxicidade no organismo. Estes devem ser biocompatíveis, não causar
quaisquer reacções imunogénicas e libertar de forma controlável o fármaco nos locais alvos, sem
alterar os seus efeitos terapêuticos. Num sistema de libertação ideal, não ocorre libertação prematura
do fármaco, a libertação é realizada no local alvo e o transportador contém um grande
armazenamento de fármaco [18].

1.7.1. Nanopartículas para libertação controlada
No tratamento do cancro, os compostos terapêuticos necessitam de ser direccionados para o
local onde estes são necessários, ou seja, apenas nas células tumorais, limitando assim os potenciais
efeitos secundários. No entanto, as moléculas são administradas sistematicamente e por sua vez,
são distribuídas pelo organismo através da circulação sanguínea e sujeitas à hidrólise, à degradação
enzimática e excreção rápida. Com um sistema baseado em nanopartículas pode-se melhorar a
biodistribuição, aumentar o tempo de circulação, e proteger o fármaco a partir do microambiente,
aumentando assim a eficácia e reduzindo os efeitos colaterais [34]. Diferentes nanopartículas podem
ser utilizadas para a entrega do fármaco, sendo que, cada uma tem as suas características e
propriedades, vantagens e desvantagens. É evidente que o potencial de interacção com células e
tecidos e a toxicidade depende muito da composição das nanopartículas. Os DDS apresentados na
Figura 13 têm diferentes propriedades físico-químicas que os tornam apropriados para diferentes
fármacos e diferentes aplicações.

11

Sistema de entrega de fármaco

Estrutura

Propriedades / Características
Forma vesículas com núcleo aquoso

Lipossomas

Encapsulação de fármaco ocorre no núcleo ou
na bicamada lipídica
Núcleo bem definido

Dendrímeros

Incorpora biomoléculas através de interacções
electroestáticas e hidrofóbicas
Nanoestrutura cilíndrica

Nanotubos de carbono

Nanotubo de parede única ou múltiplas
paredes
Fotossensíveis

Nanopartículas de ouro
Utilizadas como núcleo
Nanopartículas superparamagnéticas
Nanopartículas de dióxido de titânio

Necessita de estímulo para libertar
biomoléculas
Estrutura nanotubular

Nanopartículas de óxido de ferro
Terapia fotodinâmica
Estrutura mesoporosa
Nanopartículas de sÍlica
Multifuncionais

Figura 13 - Diferentes tipos de sistemas de entrega de fármacos (adaptada de [17]).

O sistema nervoso central, um dos microambientes mais delicados do corpo, é protegido pela
barreira hematoencefálica (Blood Brain Barrier, BBB) que regula a homeostasia. A BBB é uma
estrutura altamente complexa, que regula o movimento de iões e moléculas a partir do sangue para o
cérebro, protegendo o cérebro de lesões e doenças. No entanto, a BBB também impede,
significativamente, a distribuição de fármacos no cérebro assim, prevenir a terapia de uma série de
distúrbios neurológicos (como Alzheimer e Parkinson) torna-se um desafio. Como consequência,
várias estratégias estão actualmente a ser estudadas para melhorar a administração de fármacos
através da BBB. A possibilidade de utilizar NPs para a entrega de fármacos no cérebro têm sido
extensivamente descrita. A sua capacidade de incorporar fármacos hidrofílicos ou hidrofóbicos e a
capacidade de serem administradas através de diferentes vias (como por exemplo, por inalação ou
via oral) faz com que as NPs sejam ainda mais atractivas [35].

1.7.2. Sistemas moleculares de libertação controlada

Os lipossomas são sistemas de entrega de fármaco bastante populares na terapia do cancro
devido à sua elevada biocompatibilidade. Os lipossomas possuem uma estrutura esférica composta
por uma ou várias bicamadas lipídicas e têm a capacidade de se organizar espontaneamente

12

consoante o meio em que se encontram. Isto deve-se ao facto de serem moléculas anfifílicas (cabeça
hidrofílica e cauda hidrofóbica). O encapsulamento do fármaco ocorre no interior da dupla camada
lipídica ou no núcleo aquoso. Outros DDS muito utilizados são também as nanopartículas de ouro, as
nanopartículas de dióxido de titânio e as nanopartículas de óxido de ferro. Contudo existem DDS que
possuem melhores características consoante a tarefa a desempenhar. Ao comparar uma
nanopartícula com um lipossoma, esta possui mais vantagens relativamente ao tamanho, à
encapsulação do fármaco, à libertação controlada e ao custo. Na Tabela 1 pode observar-se a
comparação entre os dois DDS mencionados [36].

Tabela 1 - Comparação entre dois sistemas de entrega de fármaco, lipossoma e nanopartícula (+: baixo;
++: moderado; +++: elevado) (adaptada de [17]).
Nanosistema

Tamanho
menor

Quantidade
de fármaco

Libertação
sustentada

Alvo

Estabilidade
in vivo

Biocompatibilidade

Baixo
custo

Lipossoma

+

+

+

++

+

+++

++

Nanopartícula

++

++

+++

++

++

++

+++

1.7.3. Sistemas poliméricos de libertação controlada
Alguns polímeros são sensíveis a estímulos. Esses estímulos são geralmente classificados em
três categorias: físicos (luz, temperatura, ultra-sons), químicos (solvente, redox, pH) ou biológicos
(enzimas, glucose, receptores). Os estímulos físicos normalmente estão associados à dinâmica da
cadeia, enquanto os químicos baseiam-se nas interacções moleculares, quer entre o polímero e as
moléculas de solvente, quer entre cadeias de polímero; os biológicos referem-se ao funcionamento
das moléculas como as reacções enzimáticas onde, por exemplo, as enzimas hidrolíticas
(glicosidases) são utilizadas para degradar o polímero. Contudo há polímeros que possuem a
capacidade de responder a dois ou mais estímulos em simultâneo [37].
Os polímeros que respondem a estímulos podem eventualmente modificar o tamanho da
cadeia, a estrutura secundária, a solubilidade e também o grau de associação intermolecular. Na
generalidade, estas alterações são provocadas pela formação ou a destruição de ligações de
hidrogénio, interacções electroestáticas ou equilíbrios ácido-base [38]. Uma característica importante
deste tipo de material é a reversibilidade da transformação. É importante reter que existe uma grande
diversidade de polímeros que possuem resposta a estímulos, contudo essa diversidade é
dramaticamente reduzida quando estes se destinam a aplicações médicas devido às restrições
biológicas existentes e à falta de biocompatibilidade. Os polímeros termossensíveis têm atraído
grande atenção em aplicações de bioengenharia e biotecnologia. Estes polímeros têm a capacidade
de responder a uma mudança de temperatura, uma propriedade que os torna materiais úteis numa
ampla gama de aplicações e, consequentemente atrai muito interesse científico.
Os polímeros termossensíveis são caracterizados por um ponto crítico onde ocorre uma
transição de fase. Esse ponto é denominado de temperatura de solução crítica inferior (Lower Critical
Solution Temperature, LCST) onde as cadeias poliméricas sofrem contracção com o aumento da
13

temperatura acima do ponto crítico ou temperatura de solução critica superior (Upper Critical Solution
Temperature, UCST) onde as cadeias poliméricas sofrem contracção ao ser arrefecido abaixo dessa
temperatura [33].
No ponto crítico, as interacções hidrofílicas e hidrofóbicas entre as cadeias poliméricas e o
meio aquoso alteram-se rapidamente com a mudança da temperatura. A temperaturas inferiores à
temperatura crítica, onde existe apenas uma fase, as ligações de hidrogénio formadas entre os
segmentos hidrofílicos da rede polimérica e as moléculas de água são as interacções dominantes,
favorecendo assim a sua expansão. Com o aumento da temperatura acima da temperatura crítica, as
interacções entre os segmentos tornam-se mais fortes, e assim as ligações de hidrogénio tornam-se
desfavorecidas. Isso leva a uma contracção do polímero, resultando num estado onde as interacções
polímero-polímero e solvente-solvente são preferenciais.
Os

polímeros

mais

comuns

com

propriedades

termossensíveis

são:

a

poli(N-

isopropilacrilamida) (PNIPAAm), com LCST cerca de 32°C, (uma temperatura muito útil para
aplicações biomédicas, uma vez que é próxima da temperatura corporal (37°C)), e o poli(etileno
glicol) (PEG), também denominado poli(óxido de etileno) (PEO) [39]. Os derivados de PEG como
Oligo(Etilenoglicol)metacrilato (OEGMA) ou 2-(2'metoxi-etoxi)etil metacrilato (MEO2MA) ganharam
atenção

dos

investigadores,

biocompatibilidade,

que

as

por
tornam

possuírem

propriedades

especialmente

úteis

químicas desejáveis, como a

para

aplicações

biológicas

e

farmacêuticas.
Lutz et al. [40] avaliaram a influência do tamanho da cadeia lateral de PEG na LCST e
observaram que há um aumento da LCST com o aumento da cadeia lateral de PEG. A LCST do
copolímero P(MEO2-MA-co-OEGMA) pode ser prevista a partir da fracção molar de OEGMA (FOEGMA)
através da equação 1.
LCST= 28 + 1,04 FOEGMA

(1)

A composição molar do copolímero (ver figura 18) foi de 8% de OEGMA e 92% de MEO 2MA, o
que significa que em 100 monómeros, 8 correspondem a monómeros de OEGMA. Assim, a LCST
prevista para o polímero sintetizado é aproximadamente 37 ºC.
No corpo humano existe diferentes níveis de pH, por exemplo, a saliva tem um pH neutro,
contudo o pH ao longo do trato gastrointestinal sofre alterações, no estômago está entre de 1 e 3 e no
intestino delgado entre 5 e 8. Já os tecidos tumorais encontram-se um pH de 6,75, o que diferencia
dos tecidos normais com pH 7,23. Com base nestas variações de pH, têm sido desenvolvidas
diversas nanopartículas sensíveis ao pH, para a entrega de fármacos, genes e proteínas. Os
polímeros sensíveis ao pH possuem grupos ionizáveis (grupos carboxilo ou amina) que podem
aceitar ou doar protões em resposta a mudanças do pH do meio ambiente onde se encontram. Estes
polímeros são por exemplo, poliacrilamida, poli (ácido acrílico) e poli(vinil piridina). Num meio ácido,
polímeros com grupos funcionais ácidos retém o fármaco e num meio alcalino o fármaco é libertado
[41].

14

2º Capítulo - Nanopartículas desenvolvidas neste trabalho
O principal objectivo deste trabalho consiste em desenvolver nanopartículas hibrídas de sílica
mesoporosa com um núcleo de sílica nanoestruturado e uma coroa polimérica biocompatível com
resposta a alterações de temperatura. Utilizaram-se polímeros PEG-acrilatos (MEO2MA e OEGMA)
que apresentam uma LCST de 37ºC, proporcionando o colapso ou a expansão da cadeia polimérica
consoante a temperatura aplicada. Quando a temperatura é elevada as cadeias poliméricas colapsam
em torno da partícula e a temperaturas inferiores à LCST as cadeias encontram-se extendidas. Este
mecanismo proporciona a abertura e fecho dos poros o que permite utilizar as MSNs como
nanocontentores para a libertação controlada do fármaco.
Uma sonda fluorescente foi incorporada nas MSNs híbridas com o intuito de estudar a
libertação controlada in vitro utilizando técnicas de fluorescência.
De forma a compreender todo o trabalho realizado na preparação de nanopartículas de sílica
mesoporosas híbridas, foram esquematizados todos os passos laboratoriais envolvidos (Figura 14).
As MSNs foram sintetizadas através da hidrólise e condensação do tetraetoxisilano (TEOS). Na
síntese, adicionou-se um corante derivado do perilenodiimida (PDI) que foi incorporado na rede de
sílica obtendo

partículas fluorescentes. Após a síntese das partículas de sílica, realizou-se a

modificação química da superfície com 3-aminopropiltrietoxisilano

(APTES) e posteriormente foi

removido o tensioativo permitindo que os mesoporos fiquem disponíveis para a difusão do solvente e
incorporação de moléculas.
Em
carboxílico

seguida,

foi imobilizado o agente RAFT na superfície das MSNs, com

o

grupo

do agente RAFT a reagir com o grupo amina da superfície das nanopartículas

imobilizando o agente RAFT. O agente RAFT permite o controlo do peso das cadeias de polímero e
consequentemente, a espessura da coroa polimérica. A polimerização RAFT associada ao método
"grafting from" foi utilizada para o crescimento do revestimento polimérico. É sintetizado um
copolímero termossensivel utilizando os monómeros 2 (2'-metoxietoxi) etil-metacrilato (MEO2MA) e
oligo (etilenoglicol) metacrilato (OEGMA). Os polímeros à base de PEG têm uma boa solubilidade em
água e solventes orgânicos, não são tóxicos nem imunogénicos e impedem a adsorção não
específica de proteínas e adesão celular [42][43].

15

Figura 14 - Processos envolvidos na preparação das nanopartículas híbridas.

Espera-se que a combinação das MSNs com o polímero termossensível possa trazer uma
grande contribuição nos estudos de libertação controlada de fármacos, uma vez que os poros das
nanopartículas de sílica se encontram disponíveis para a incorporação de moléculas e a sua
libertação é controlada pelo comportamento que o polímero apresenta com a alteração da
temperatura. Pretende-se que o polímero termo sensível colapse com o aumento da temperatura e
expanda quando sujeito a temperaturas mais baixas (Figura 15).

Figura 15 - Comportamento esperado do polímero termossensível quando é aplicada temperatura.

Foram utilizadas as técnicas de Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM) e Dispersão de
Luz Dinâmica (DLS) para a caracterização das nanopartículas em termo de dimensão e
polidispersidade. Também foram realizadas medidas da fluorescência e absorção das diferentes
amostras. Para o estudo da libertação das moléculas da sulforodamina B incorporadas nas MSNs
foram realizadas cinéticas para verificar a utilização destas partículas como sistema de libertação
controlada de fármacos.
16

3º Capítulo ­ Parte Experimental
3.1. Materiais
O etanol absoluto (EtOH, 99,9% Scharlau), o tetraetoxisilano (TEOS, 98% Aldrich), o brometo
de cetiltrimetilamónio (CTAB, 99% Sigma) e a solução de hidróxido de amónio (NH4OH, 25% Fluka)
foram utilizados sem qualquer purificação na síntese das nanopartículas de sílica mesoporosas. O
corante incorporado nas MSNs, bis(propil)trietoxisilanoperilenodiimida (PDI), foi sintetizado pelo grupo
de acordo coma literatura [44].
A superfície das nanopartículas foi modificada com (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES, 98%
Sigma-Aldrich) em tolueno seco (tolueno comercial seco com hidreto de cálcio e destilado).
Para a remoção do tensioactivo utilizou-se uma solução de 0,5M de ácido clorídrico (HCl, 37%
Panreac) em etanol absoluto.
O

acoplamento

etilcarbodiimida

do

(EDC,98%

agente

RAFT

Sigma-Aldrich)

foi

em

feito

utilizando

diclorometano

N-(3-dimetillaminopropil)-N-

comercial

e

destilado

e

3-

(benzylsulfanylthiocarbonylsulfanyl) propionicacid como agente RAFT, sintetizado pelo grupo como
descrito na literatura [45].
Os monómeros utilizados na polimerização foram oligo(etileno glicol) metacrilato (OEGMA,
98% Sigma-Aldrich), 2-(2-metil ethoxy)etilmetacrilato (MEO2MA, 95% Sigma-Aldrich), como iniciador
utilizou-se

2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo)

(AIBN,

99%

Sigma-Aldrich),

todos

sem

qualquer

purificação.
Na preparação das amostras para medir o diâmetro hidrodinâmico e o potencial Zeta foram
utilizadas seringas de plástico de 3mL da B-BRAUN e água purificada por um sistema MilliporeMilli-Q
18 Mcm. Para a medição do diâmetro hidrodinâmico, as amostras foram preparadas com dodecil
sulfato de sódio (SDS, 99% Fluka) e filtradas com filtros de celulose 0,45 m. Para medir o potencial
zeta utilizaram-se células DTS1070.
Para preparar o tampão fosfato foi utilizado fosfato monossódico (NaH2PO4, 98% Panreac),
fosfato disódico (Na2HPO4, 99 % Riedel-de-Haën) e hidróxido de sódio (NaOH, 98% Sigma-Aldrich).
No estudo da libertação com as nanopartículas híbridas foi utilizada sulforodamina B (SRB, Molecular
probes), um tampão fosfato com pH aproximado de 7 e dispositivos de diálise de polipropileno com
uma membrana de celulose (Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10K MWCO).

3.2. Métodos
3.2.1. Síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (MSNs)
As MSNs foram sintetizadas pelo método sol-gel. Num frasco de polipropileno dissolveram-se
0,113 g de CTAB em 58,7 mL de uma solução aquosa de NH4OH (0.5 M) a 50ºC. Após o CTAB estar
dissolvido, adicionaram-se 2,5 mL de uma solução de TEOS (0,2 M em etanol) e 9,7 mL de etanol
17

absoluto. A adição da solução de TEOS e de etanol foi efectuada gota a gota e a mistura manteve-se
em agitação a 50ºC durante 5 horas. Ao fim desse tempo, as mesmas quantidades foram novamente
adicionadas à mistura reaccional e esta foi mantida por mais 1h nas mesmas condições. Por fim, a
dispersão foi colocada na estufa a 50ºC durante 24 horas. A dispersão foi centrifugada a 19118 g
durante 20 minutos e dispersada duas vezes numa solução de etanol e água (50% V/V) e três vezes
em etanol destilado. As nanopartículas foram secas na estufa a 50 °C [46].

3.2.2. Nanopartículas de sílica mesoporosas marcadas com PDI (MSN-PDI)
Para as nanopartículas marcadasz com PDI, preparou-se previamente uma solução de PDI em
etanol (6 mg de PDI em 15 mL de etanol absoluto). A solução foi colocada nos ultra-sons de forma a
dissolver o PDI e posteriormente mediu-se a absorvância para determinar a concentração. A síntese
das MSNs foi realizada da mesma forma como descrita anteriormente contudo, após a adição da
solução de TEOS (0,2 M em etanol) adicionou-se 0,5 mL da solução de PDI e 9,2mL de etanol
absoluto. Foi preparada uma solução de PDI diferente para cada síntese.

3.2.3. Funcionalização da superfície das MSNs com APTES (MSN-PDI-APTES)
Para modificar a superfície com APTES, as MSNs foram dispersas em tolueno seco e levadas
a ultra-sons durante 10 min. O APTES foi adicionado à dispersão e a mistura foi aquecida a 125º C e
deixada sob refluxo durante 24 horas, sob atmosfera de árgon. Por fim, as nanopartículas foram
centrifugadas em três ciclos (19118 g, 20 min) e redispersas em etanol absoluto. No último ciclo
retirou-se o sobrenadante e colocou-se as partículas a secar na estufa a 50ºC. O rácio da mistura
reaccional utilizado foi 0,2 g MSNs: 10 mL tolueno: 0,468 mL APTES [9]. A reacção está representada
na Figura 16.

Figura 16 - Esquema representativo do processo de modificação da superfície das MSNs com APTES.

3.2.4. Remoção do tensioativo
Para remover o tensioativo, as partículas lavadas e secas foram colocadas num frasco de
polipropileno juntamente com uma solução de HCl 0,5 M em etanol. A mistura foi mantida durante 2
horas, em agitação, a 40 ºC. Por cada 500 mg de MSNs foram utilizados 20 mL da solução de HCl.

18

As nanopartículas foram centrifugadas três vezes com etanol (19118 g, 10 min) e posteriormente
secas a 50ºC [9].

3.2.5. Adição do agente RAFT (CTA)

O último passo antes da polimerização na superfície das MSNs foi a ligação do agente RAFT,
pelo grupo R, na superfície das nanopartículas de sílica. Essa ligação ocorre devido à presença dos
grupos amina na superfície das partículas.
Num tubo de schlenk foram introduzidas as MSNs funcionalizadas com APTES e o agente
RAFT. O EDC foi pesado num frasco e adicionou-se diclorometano seco. De seguida, transferiu-se a
mistura para o tubo de schlenk onde a reacção prosseguiu durante 24 horas com agitação e sob
atmosfera de árgon à temperatura ambiente. Finalmente, as MSNs foram centrifugadas três vezes em
etanol (19118 g, 20 min) e secas a 50ºC na estufa. Para efeito de cálculo, admitiu-se que a
concentração de APTES é de 0,04 mmol/g de sílica conforme a literatura.[9] A reacção está
representada na figura 17.

Figura 17 - Representação esquemática da reacção das MSN-APTES com o agente RAFT.

Na tabela 2, estão apresentadas as quantidades de partículas de cada amostra, após remoção
do tensioativo, utilizadas neste processo e as respectivas quantidades dos reagentes.
Tabela 2 - Reagentes e quantidades utilizadas na modificação da superfície das nanopartículas de sílica
com agente RAFT.

Amostra
MSNs 2a
MSNs 3a
MSNs 3b
MSNs 5b
MSNs 7a
MSNs 7b

MSN
(mg)
36,8
70,0
49,5
41,4
29,0
49,7

EDC
(mg)
2,8
5,2
3,7
3,1
2,2
3,7

Agente RAFT CH2Cl2
(mg)
(ml)
4,0
0,736
7,6
1,400
5,4
0,992
4,5
0,828
3,2
0,580
5,4
0,994

19

3.2.6. Polimerização por RAFT (MSN-POLI)
A polimerização por RAFT foi realizada para sintetizar um copolímero formado por uma mistura
de dois PEG-acrilatos. Os monómeros utilizados são o oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e o
2-(2'Metoxi-Etoxi)etilmetacrilato (MEO2-MA).
Num tubo de schlenk equipado com um agitador magnético pesaram-se os monómeros (MEO2MA e OEGMA) as MSNs e adicionou-se etanol à mistura reaccional. A mistura foi colocada durante
30 minutos nos ultra-sons. Num balão volumétrico de 10 mL pesou-se o AIBN e perfez-se o balão
volumétrico com etanol. Ambas as soluções foram colocadas 45 minutos em agitação, a temperatura
ambiente sob atmosfera de árgon. Ao fim desse tempo, o tubo de schlenk foi colocado num banho de
óleo a 70ºC e adicionaram-se 30 L da solução de AIBN. A mistura reacional foi mantida em
atmosfera inerte durante 24 horas, ao abrir e expor o conteúdo ao ar a reacção de polimerização
termina. No final da polimerização, as nanopartículas foram lavadas e redispersas três vezes em
etanol (8497 g, 10 min). A estrutura molecular dos monómeros escolhidos para a polimerização das
partículas encontra-se na figura 18.

Figura 18 - Estrutura molecular dos monómeros oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e 2-(2-metil
ethoxi) etilmetacrilato (MEO2-MA).

A quantidade de RAFT presente, a razão molar iniciador/CTA e o número de monómeros por
cadeia para cada polimerização estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3 - Razão molar, quantidade de RAFT e número de monómeros por cadeia utilizado em cada
polimerização.

Amostra
MSNs 2a
MSNs 3a
MSNs 3b
MSNs 5b
MSNs 7a
MSNs 7b

Quantidade RAFT
(mmol/g)
0,064
0,056
0,052
0,061
0,050
0,045

Razão molar
[Iniciador]/[CTA]
1/10
1/5
1/5
1/10
1/10
1/10

Número de monómeros
esperados por cadeia
400
140
140
750
750
750

20

3.2.7. Incorporação e libertação nas MSN-POLI

Uma solução de tampão fosfato foi preparada pesando 6,58 g de fosfato monossódico
(NaH2PO4) e 7,42 g de fosfato dissódico (Na2HPO4) para um frasco de polipropileno. A mistura foi
dissolvida em 93 mL de água. O pH do tampão fosfato foi medido e acertado para um pH próximo de
7 com uma solução de NaOH (10M).
-5

Preparou-se uma solução de sulforodamina B (SRB) em tampão fosfato (PBS) (1,04×10 M) e
foram realizadas duas cinéticas a 20 e a 50ºC de forma a obter as intensidades de fluorescência da
SRB durante 4 horas. Colocaram-se 200 L da solução no tubo de diálise e 3,5 mL PBS numa célula
com agitador. Foi realizada também uma cinética com alteração de temperatura de 20 em 20
minutos, com início a 50ºC e com 4 horas de duração. Para a incorporação de sulforodamina B nas
nanopartículas híbridas (MSN-SRB) foi preparada uma solução de SRB em tampão fosfato pH 7
-3

(4,47×10 M). Primeiro, as MSN-POLI (3 mg, que foram secas na estufa a 50ºC) foram adicionadas a
3 mL da solução de SRB e a mistura ficou a agitar durante a noite a 20ºC. Alterou-se a temperatura
para 50ºC e ao fim de 3 horas retirou-se 1 mL dessa dispersão. Centrifugou-se (10 min, 8497 g, 40
ºC) três vezes e redispersaram-se as MSNs em PBS, de forma a remover a SRB que não foi
incorporada. Os sobrenadantes foram guardados para quantificar a SRB que se não incorporou nas
MSN-POLI. A quantidade de SRB incorporada nas MSN-POLI foi calculada a partir da diferença entre
a concentração da solução inicial de SRB usada na incorporação e a concentração dos
sobrenadantes após a centrifugação. Para a experiência de libertação, 200 l da dispersão com
MSN-POLI e SRB, foram colocados num tubo de diálise e numa célula foram introduzidos 3,5 mL de
PBS e um agitador magnético. Foi realizada uma cinética com alteração de temperatura de 20 em 20
minutos entre 20ºC e 50ºC com início a 50ºC durante 4 horas.

3.3. Equipamento
3.3.1.Centrífuga
A centrífuga Sigma 2K15, rotor 12141,foi utilizada para as lavagens das MSNs. Esta atinge
uma velocidade máxima de 15300rpm e força gravitacional de 20150×g. Os tubos utilizados foram de
polipropileno com capacidade de 10 mL.
No final de cada processo de modificação das MSNs foram retiradas amostras para eppendorfs
de 1,5mL para medir o potencial zeta e o diâmetro hidrodinâmico. Nas lavagens dessas amostras foi
utilizada a centrífuga Hitachi himac CT 15RE.

3.3.2. Dispersão de luz dinâmica
Para obter o tamanho das partículas foi utilizado o Zetasizer Nano ZS, model ZEN3600, com o
detector a 173º e 90º. Este sistema determina o tamanho das partículas através do movimento
Browniano baseando-se na dispersão de luz dinâmica (DLS). Uma característica importante do
21

movimento Browniano é que pequenas partículas movem-se rapidamente num líquido e partículas
grandes movem-se lentamente. Isto deve-se ao facto do coeficiente de difusão relacionar-se com o
raio das partículas pela equação de Stokes-Einstein.
As flutuações da intensidade de luz espalhada são convertidas em pulso eléctricos, que são
alimentados por um correlacionador digital. Este gera uma função de autocorrelação a partir do qual
se relaciona o coeficiente de difusão das partículas com o tamanho. As funções de autocorrelação
são analisadas pelo método CONTIN para determinar o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas
(Dh).

3.3.3. Microscopia electrónica de transmissão
Com a microscopia electrónica de transmissão (TEM) é possível observar os poros das MSNs
e determinar o diâmetro das partículas. Utilizou-se um microscópio da marca Hitachi, modelo H-8100,
com filamento LaB6 e uma tensão de aceleração de 200 kV. As amostras analisadas foram
preparadas colocando uma gota da amostra, em água ou etanol, em grelhas de cobre. Após a
secagem ao ar, as grelhas de cobre foram transferidas, com uma pinça, para o suporte e inseridas no
microscópio. Este aparelho está equipado com uma câmara KeenView da Soft Imaging System que
utiliza o programa iTEM para adquirir as imagens.

3.3.4. Potencial Zeta

O potencial Zeta é a diferença do potencial entre o meio de dispersão e a camada
estacionária do fluido ligada à partícula dispersada. Para caracterizar as cargas superficiais das
nanopartículas mediram-se os potencias Zeta () de diferentes amostras. Os valores do potencial zeta
foram obtidos utilizando medidas de mobilidade electroforética realizadas num Zetasizer Nano ZS,
model ZEN3600 (Malvern Instruments). O potencial zeta é calculado automaticamente a partir da
mobilidade electroforética baseada na equação de Smoluchowski [47]. Como solvente foi utilizada
água milipore e as medições foram efectuadas a 25º C.

3.3.5. Espectroscopia de fluorescência
Os espectros de emissão e excitação foram obtidos no Horiba-JobinYvon Fluorolog-3
spectrofluorimeter, em modo Right Angle e as medidas foram efectuadas em células de Quartzo com
dimensões de 1cm x 1cm à temperatura ambiente.

3.3.6. Espectroscopia UV/Vis

Os espectros de absorvância foram registados num espectrofotómetro Jasco V-660. Todos os
espectros obtidos foram realizados à temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com
dimensões de 1cm x 1cm.
22

4º Capítulo- Apresentação e discussão dos resultados
4.1. Caracterização óptica das partículas
A solução de PDI usada na síntese de nanopartículas fluorescentes foi preparada em etanol. A
concentração da solução foi obtida medindo a absorvância e usando a Lei de Lambert-Beer.
A=bc

(2)

Onde corresponde ao coeficiente de absortividade molar para o PDI usado em etanol (= 41053 M
1

-

-1

cm )[48], b é a espessura da célula (b=1cm) e c indica a concentração. Na figura 19 encontra-se o

espectro de absorvância da solução de PDI utilizada na síntese das amostras MSN 3a e 3b. Os
espectros de absorvância das soluções de PDI preparadas para as sínteses MSN 2 e MSN 7
encontram-se no anexo 1.
0,1

Absorvância

0,08
0,06
0,04
0,02
0
400

500

600

700

Comprimento de onda (nm)
Figura 19 - Espectro de absorção da solução de PDI em etanol utilizadas nas sínteses MSN-PDI 3a e 3b.

Na Tabela 4 estão apresentados os valores de absorvância a 521 nm para cada solução de
PDI e as respectivas concentrações.

Tabela 4 - Concentração da solução de PDI obtida a partir de medições de absorvância em etanol.

Abs PDI

Amostra

=521nm

C (mol/L)

MSNs 2a
MSNs 3
MSNs 7

0.0794
0.0389
0.1145

1.42×10
-5
2.90×10
-5
4.18×10

-5

23

As medidas de fluorescência para obter os espectros de emissão e excitação das
nanopartículas de sílica com PDI foram realizadas com dispersões limpas, (ou seja, depois de
centrifugadas), com iluminação em ângulo recto, em células de plástico. As medidas da solução de
PDI em etanol foram feitas numa célula de quartzo também com iluminação em ângulo recto. Os
espectros normalizados de emissão e excitação do PDI e da dispersão de nanopartículas com PDI,
em etanol, são apresentados na Figura 20. Comparando estes espectros, observou-se que as formas
dos espectros de fluorescência para as nanopartículas MSN-PDI 7a são muito semelhantes aos
espectros do PDI em solução, podendo assim concluir que as moléculas de PDI não sofreram
alterações quando incorporadas nas nanopartículas de sílica.

Intensidade (u.a)

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
400

500
600
Comprimento de onda (nm)

700

Figura 20 - Comparação dos espectros normalizados de excitação (a tracejado, emi=560 nm) e emissão
(linhas continuas, exc=500 nm) para o PDI em etanol (vermelho) e MSN-PDI 7a (azul).

4.2. Determinação da concentração do agente RAFT por UV/Vis
De forma a calcular a concentração do agente RAFT na superfície das MSNs, foram obtidas
espectros de absorvância das partículas com NH2 e com o agente RAFT na superfície, em dioxano.
Na figura 21 encontra-se o espectro de absorvância correspondente à amostra MSNs 2a. Seguiu-se o
mesmo procedimento para as restantes amostras.

24

3

Absorvância

2,5

2
1,5
1
0,5

0
250

350

450

550

650

750

Comprimento de onda (nm)
Figura 21 - Espectro de absorção do agente RAFT (a verde) e das MSNs com NH2 na superfície (a
cinzento) da amostra MSNs 2a, em dioxano.

As concentrações de agente RAFT (Tabela 5) foram obtidas medindo a absorvância e
aplicando a Lei de Lambert-Beer (eq.1), conhecendo o coeficiente de absortividade molar do agente
-1

-1

RAFT em dioxano (=13975 M cm ) [48] e a espessura da célula (b=1cm).
A absorvância utilizada para determinar a concentração do agente RAFT foi corrigida
subtraindo o valor de absorvância máxima do espectro do agente RAFT ao valor de absorvância
correspondente ao mesmo comprimento de onda para o espectro de MSNs com NH 2.
A concentração do agente RAFT na superfície é bastante importante para a etapa da
polimerização pois, a quantidade de iniciador a utilizar é definida pela razão [iniciador]/[CTA]. O
iniciador, ou seja, o AIBN tem influência no tamanho das cadeias de polímero. Quanto maior a
quantidade de AIBN, mais radicais são gerados para reagirem com os monómeros, logo existe menos
monómeros por cadeia e como consequência o peso molecular é menor. A concentração de iniciador
é normalmente dez vezes menor do que a concentração do agente RAFT. O dioxano foi escolhido
como solvente uma vez que o seu índice de refracção (RI) é semelhante ao RI das nanopartículas de
sílica.
Tabela 5 - Concentração do agente RAFT na superfície das nanopartículas obtido a partir de medições de
absorvância em dioxano.

Amostra
MSNs 2a
MSNs 3a
MSNs 3b
MSNs 5b
MSNs 7a
MSNs 7b

Abs MSN-RAFT Abs.corrigida Conc.(mmol/L) mmol RAFT/g partículas
2,812
2,981
2,886
2,848
2,704
2,743

1,480
1,304
1,208
1,415
1,159
1,052

0,106
0,093
0,086
0,101
0,083
0,075

0,064
0,056
0,052
0,061
0,050
0,045

A partir da concentração do agente RAFT e sabendo a massa das MSNs (0,005 g) e o volume
de dioxano (0,003 L) utilizado, calculou-se a quantidade de RAFT por grama de partículas.
25

4.3.Caracterização das MSNs
Os diâmetros das nanopartículas de sílica mesoporosas foram medidos usando DLS e TEM,
assim como as nanopartículas hibrídas compostas por um núcleo de sílica mesoporosa e uma coroa
polimérica.

4.3.1. Nanopartículas de sílica mesoporosas
As dispersões de nanopartículas em água foram medidas por DLS a temperatura controlada de
20ºC e por TEM de forma a obter os diâmetros das nanopartículas de sílica. A Tabela 6 apresenta as
médias dos diâmetros das partículas e desvios-padrão por DLS e TEM e a figura correspondente de
cada amostra. Através da determinação dos diâmetros das nanopartículas de sílica por TEM e DLS
pode-se observar que o diâmetro por DLS é maior que o observado por TEM, indicando a tendência
das mesmas para agregar em dispersão, sabendo contudo que o diâmetro por DLS é normalmente
superior ao do TEM devido à existência de uma camada de hidratação em torno da partícula,
enquanto no TEM a amostra encontra-se seca numa grelha.

Tabela 6 - Diâmetro médio e desvio padrão de cada amostra de MSNs, obtido por DLS e TEM.

Amostra

Dh (nm)

DTEM (nm)

Figura

MSN-PDI 2a

210±7

150±32

22 (A)

MSN-PDI 3a

220±5

160±35

22 (B)

MSN-PDI 3b

180±14

170±27

22 (C)

MSN-PDI 5b

170±2

160±34

23 (A)

MSN-PDI 7a

160±2

140±38

23 (B)

MSN-PDI 7b

170±10

160±44

23 (C)

Para determinação do diâmetro hidrodinamico médio das partículas, efectuaram-se três
medições para cada amostra e no TEM foram quantificadas, aproximadamente, cinquenta partículas.
A caracterização das nanopartículas por TEM permitiu obter a distribuição de diâmetros por
análise das imagens recorrendo ao software Fiji (Anexo 3). As figuras 22 e 23 mostram as imagens
obtidas por TEM e as respectivas distribuições de diâmetros de cada amostra, tendo-se desprezado
os agregados, para o cálculo dos diâmetros.

26

Figura 22 ­ Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses
MSN-2a ( A, escala 1000nm), MSN-3a (B, escala 500nm), MSN-3b (C, escala 200nm) e respectivo
histograma da distribuição dos diâmetros (à direita).

27

Figura 23 - Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-5b (A,
escala 1000nm), MSN-7a (B, escala 500nm), MSN-7b (C, escala 200nm) e respectivo histograma da
distribuição dos diâmetros (à direita).

Através das imagens obtidas por TEM ainda foi possível verificar a porosidade das partículas
de sílica visualizando pequenos pontos no seu interior, contudo em algumas imagens de TEM não é
possível observar os poros com boa definição devido à orientação destes. Na figura 24 encontra-se
uma imagem ampliada de uma partícula correspondente à síntese MSNs 3b onde se observam os
mesoporos.

28

Figura 24 - Imagem obtida por TEM da amostra MSNs 3b (200nm) ampliada para uma escala de 100nm.

4.3.2. Nanopartículas de sílica mesoporosas com revestimento polimérico
Ao realizar o DLS das partículas MSN-POLI observou-se que a modificação da superfície das
nanopartículas com PEG permitiu prevenir a agregação destas tornando-se mais fácil a obtenção dos
diâmetros comparativamente às partículas de sílica MSN-PDI.
Os diâmetros hidrodinâmicos médios a 25 e 40ºC das partículas MSN-POLI determinados por
DLS para cada amostra, encontram-se na Tabela 7. Verificou-se que houve um aumento dos
diâmetros a 25º C quando comparados com as MSN-PDI, o que comprova a existência de uma coroa
polimérica. Com o aumento da temperatura para 40º C verificou-se uma diminuição dos diâmetros
relativamente aos diâmetros a 25ºC, o que indica que a baixas temperaturas o polímero se encontra
expandido e a temperatura elevada o polímero colapsa [6]. O diâmetro hidrodinâmico das MSN-POLI
a 40ºC é, em algumas amostras, inferior ao diâmetro hidrodinâmico das MSN-PDI, visto que as
nanopartículas de sílica (MSN-PDI) têm mais tendência para agregarem do que as nanopartículas de
sílica com coroa polimérica (MSN-POLI) que são mais estáveis e por isso estão melhor dispersas.
Comparando o diâmetro das MSNs medido por TEM (Tabela 6) com o diâmetro hidrodinâmico
a 40ºC (Tabela 7) verifica-se que em alguns casos o diâmetro das MSN-POLI é inferior ao diâmetro
das MSN-PDI por TEM. Este resultado pode estar relacionado com o facto de algumas partículas
MSN-POLI terem sedimentado durante a experiência, ficando apenas as partículas menores em
suspensão, o que explica que as partículas com polímero possam aparentar diâmetros inferiores ao
das nanopartículas de sílica.

29

Tabela 7 - Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de sílica a 25º C e nanopartículas híbridas de
resposta térmica em água a 25 e 40 º C, medida por DLS.

Amostra
MSN 2a

Dh MSN-PDI
(nm) 25ºC
210±7

Dh MSN-POLI
(nm) 25ºC
270±21

Dh MSN-POLI
(nm) 40ºC
180±26

MSN 3a

220±5

210±11

150±7

MSN 3b

180±14

290±5

180±10

MSN 5b

170±2

190±2

140±1

MSN 7a

160±2

310±16

180±12

MSN 7b

170±10

190±5

150±3

Na Figura 25, encontram-se as imagens obtidas por TEM das nanopartículas revestidas com
polímero e a distribuição dos diâmetros a diferentes temperaturas realizadas por DLS. As imagens
A,D e E da Figura 25 confirmam a polimerização das nanopartículas de sílica mesoporosas visto que
é possível visualizar uma camada em torno do núcleo de sílica. Nas imagens B e C a camada de
polímero em torno das partículas não é visível por TEM devido à razão molar iniciador/CTA destas
sínteses ter sido diferente (Tabela 3). A presença da coroa polimérica é mais visível na Figura 26.
O efeito da temperatura nas cadeias poliméricas foi analisado pela medição da variação dos
diâmetros hidrodinâmicos com a temperatura. As medidas de DLS foram realizadas de 5 em 5ºC para
a amostra MSN-POLI 2a (Figura 25 A) e de 2 em 2ºC para as restantes amostras de MSN-POLI
(Figura 25 B,C,D e E), registando-se no mínimo 3 medições para cada temperatura. Na distribuição
dos diâmetros por DLS observou-se que ocorreu alteração do tamanho dos diâmetros das
nanopartículas com a mudança da temperatura.
As LCSTs foram obtidas através de um ajuste com três linhas de tendência diferentes, uma
linha para os pontos no nível superior (antes do colapso) e outra linha para os pontos no nível inferior
(após o colapso). Uma terceira linha de tendência foi elaborada para os pontos no nível de transição.
Para as MSN-POLI 2a e MSN-POLI 7a obteve-se uma LCST de 36,3ºC e 35,6ºC respectivamente,
enquanto para MSN-POLI 3a, MSN-POLI 3b, MSN-POLI 5b calculou-se uma LCST de 32,4ºC, 33,3ºC
e 30,5ºC. A LCST foi caracterizada entre 30 a 36ºC, isto poderá dever-se ao facto das cadeias
poliméricas estarem ancoradas na superfície das nanopartículas o que complica a sua
caracterização.

30

A

B

C

D

E

Figura 25 - Imagens TEM de MSN-POLI 2a (A, 200nm), MSN-POLI 3a (B, 100nm), MSN-POLI 3b (C, 200nm),
MSN-POLI 5b (D, 200nm), MSN-POLI 7a (E, 100nm) à esquerda e gráfico de DLS com o aumento de
temperatura (20 a 50ºC) à direita.

31

Na figura 26 pode observar-se o comportamento das nanopartículas revestidas com polímero
quando estas são sujeitas ao aumento e diminuição da temperatura. No início da experiência a 20ºC
as partículas têm um diâmetro de 218 nm e a 50ºC o diâmetro registado é de 116 nm. Neste caso
ocorreu o colapso das cadeias poliméricas pois houve uma diminuição do diâmetro com o aumento
da temperatura. Pelo contrário, quando se baixa a temperatura de 50 para 20ºC, foi registado um
diâmetro de 114 nm a 50ºC e de 208 nm a 20ºC o que indica que houve uma expansão das cadeias
poliméricas. Os diâmetros das MSN-POLI a 50ºC são inferiores ao diâmetro obtido por TEM das
MSN-PDI o que indica que poderá ter ocorrido sedimentação das nanopartículas de maiores
dimensões.

Figura 26 - Imagem TEM de MSN-POLI 7b (à esquerda) e gráfico de DLS a diferentes temperaturas, para o
ciclo de aquecimento (20- 50ºC, a preto) e de arrefecimento (50 - 20ºC, a cinzento).

4.4. Determinação do potencial zeta
O potencial zeta (ZP) de uma amostra é frequentemente utilizado como indicador de
estabilidade de uma dispersão, quanto maior o potencial zeta (em módulo) maior é a probabilidade da
dispersão ser estável, pois as partículas carregadas repelam-se e essa força supera a tendência de
agregação. Como tal, é conveniente que as partículas tenham um elevado potencial zeta, negativo ou
positivo [42].
O potencial zeta foi medido em todos os passos de preparação das nanopartículas híbridas de
forma a obter informações sobre a sua carga na superfície. Na figura 27 encontram-se os potenciais
zeta obtidos antes e depois da funcionalização com APTES, com o agente RAFT e com polímero.

32

Figura 27 - Potencial Zeta das amostras com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero (MSNPOLI).

Na figura 28 verifica-se que as MSN-PDI,(sem modificação da superfície e sem tensioactivo,
apresentam potenciais zeta negativos. Isto deve-se ao facto dos grupos silanol em água estarem
desprotonados, pois estes têm o ponto isoeléctrico a um pH igual a 1,5 e a água millipore encontra-se
a um pH aproximadamente de 5, o que origina carga negativa na superfície. Segundo a literatura [49],
o pKa do grupo aminopropil é de 9,8 e o ponto isoeléctrico é de 10,6, pelo que os grupos amina das
partículas se encontram protonados, dando origem a carga positiva na superfície. Pode-se observar
que o ZP das nanopartículas modificadas com o agente RAFT alterou-se devido aos grupos ácido
do agente RAFT que reagem com os grupos NH2 existentes na superfície da sílica. O potencial
zeta das partículas de sílica com polímero (MSN-POLI) aumentou em relação ao das nanopartículas
com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT), confirmando a modificação da superfície das nanopartículas
com o polímero. As polimerizações das diferentes amostras de MSNs foram realizadas com sucesso
como se pode observar na Tabela 8.

Tabela 8 - Potencial Zeta das amostras de MSNs com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com
polímero (MSN-POLI).
Potencial Zeta (mV)
Amostra

MSN-PDI-RAFT

MSN-POLI

MSNs 2a
MSNs 3a
MSNs 3b
MSNs 5b
MSNs 7a

-35,23
-10,5
-5,18
-28,5
-10,18

23,57
16
24,47
30,97
31,4

33

4.5. Incorporação e libertação de sulforodamina B nas MSN-POLI
Com este estudo pretendeu-se testar a libertação controlada de moléculas de sulforodamina B
(SRB, moléculas hidrofílicas) incorporadas em nanopartículas de sílica mesoporosas revestidas com
uma coroa polimérica. A libertação controlada foi efectuada com o estímulo da temperatura. Este
estudo é inovador visto que não se encontram descritos na literatura sistemas de libertação
controlada com resposta à temperatura com o mecanismo descrito. O sistema apresentado é
somente um modelo, isto é, uma prova de conceito.

4.5.1. Incorporação de sulforodamina B nas MSN-POLI
A incorporação de fármacos em nanopartículas pode ser obtida por dois métodos: a
incorporação do fármaco durante a síntese das nanopartículas ou adsorção do fármaco após a
formação de nanopartículas. O método mais frequente para a incorporação do fármaco é a adsorção
em solução. Nas nanopartículas de sílica, os grupos silanol, presentes na superfície servem como
locais de adsorção. A elevada área superficial e elevado volume dos poros das MSNs permite que
estas sejam carregadas com quantidades significativas de fármaco. O carregamento das MSNs é
normalmente realizado na ordem das centenas de miligramas de fármaco por grama de MSNs. A
libertação do fármaco incorporado em MSNs pode ser estudada por difusão de moléculas através de
uma membrana de celulose ou por degradação dos sistemas de libertação, isto é, ocorre a
degradação das nanopartículas ou polímero e permite a libertação das moléculas para o meio
[11][50].
A sulforodamina B (SRB) foi utilizada neste estudo para incorporar nas MSNs e testar as
nanopartículas híbridas pois tem elevado rendimento quântico. O espectro de absorção da solução de
-7

SRB utilizada (Figura 28 A) foi obtido para uma concentração de 5,96×10 M. Com o coeficiente de
4

-1

absortividade molar da SRB (=7373×10

-1

M cm ) com espectros de absorvância de cada

sobrenadante (Figura 28 B) foram calculadas as concentrações de cada sobrenadante diluído em
tampão fosfato.

0,05

0,05

A

B
0,04

Absorvância

Absorvância

0,04
0,03
0,02

0,03
0,02
0,01

0,01

0

0
450

500

550

600

Comprimento de onda (nm)

650

450

500

550

600

650

Comprimento de onda (nm)

Figura 28 - Espectro de absorção da solução de SRB em tampão fosfato (A) e dos sobrenadantes (B).
Sobrenadante 1 (azul), sobrenadante 2 (verde) e sobrenadante 3 (roxo) após a incorporação de SRB nas
MSN-POLI e centrifugação.

34

Após obter as concentrações de cada sobrenadante na célula (c(M)célula) foram calculadas as
concentrações antes das diluições e o número de moles de cada sobrenadante (tabela 9). A
quantidade de SRB que incorporou nas MSN-POLI 2a foi calculada a partir da diferença entre a
-3

concentração da solução inicial de SRB usada na incorporação (4,47×10 M) e as concentrações dos
sobrenadantes após a centrifugação (tabela 9).

Tabela 9 - Concentrações dos sobrenadantes na célula de quartzo e número de moles de SRB nos
sobrenadantes.
Sobrenadante 1 Sobrenadante 2
c (M) célula

6,066×10

n (mol)

3,83×10

-7

-7

2,024×10
1,21×10

Sobrenadante 3

-7

-7

4,93×10

-7

6,27×10

-8

Tabela 10 - Número de moles de SRB usadas na incorporação, nos sobrenadantes e que ficaram nas
MSN-POLI 2a.
SRB na incorporação
n (mol)

4,47×10

-6

SRB nos sobrenadantes
5,66×10

-7

SRB nas MSN-POLI 2a
3,91×10

-6

4.5.2. Estudo da libertação controlada nas MSN-POLI
No estudo de libertação de moléculas de SRB foi utilizada a amostra MSN-POLI 2a. Foram
obtidos espectros fluorescência (exc=520 nm) e excitação (emi = 620 nm) da SRB a 20ºC e a 50ºC
(Figura 29) visto que o estudo de libertação consiste na observação do comportamento da coroa
polimérica das nanopartículas, que têm uma LCST aproximadamente a 37ºC. Estas duas
temperaturas foram escolhidas devido ao facto de abrangerem a temperatura da fase de transição do
polímero.
Na figura 29, nota-se que a intensidade de fluorescência a 50ºC é menor comparativamente
com a de 20ºC e este facto deve-se à diminuição de rendimento quântico com o aumento da
temperatura (aumento das componentes não radiativas e consequentemente uma diminuição do
rendimento quântico). Assim, calculou-se a razão de intensidades de fluorescência (RI) a 50ºC e a
20ºC ao comprimento de onda máximo.

35

Figura 29 - Espectros de excitação (linhas a tracejado) e emissão (linhas continuas) da SRB a 20ºC
(vermelho) e 50ºC (azul), com emi = 620 nm e exc=520 nm.

No estudo de libertação foi utilizada uma célula de plástico contendo tampão fosfato (PBS) e
um agitador, e um tudo de diálise com uma membrana de celulose na base. O aumento da
fluorescência foi seguido no compartimento B (Figura 30). O tubo de diálise deve estar em contacto
com o tampão contido na célula para que ocorra a passagem de moléculas através dos poros da
membrana. Num tubo de diálise foi colocada uma solução de SRB e noutro tubo de diálise
nanopartículas carregadas com SRB. A libertação foi estudada por difusão da SRB através da
membrana de celulose que não permite a difusão de partículas.

Figura 30 ­ Imagem representativa da preparação da amostra para a realização do estudo de libertação.
O tudo de diálise (A) é composto por uma membrana de celulose na base e a célula de plástico (B)
contem tampão fosfato (pH~7).

Para estudar o comportamento da membrana com a temperatura foram realizadas duas
cinéticas com SRB, uma a 20ºC e outra a 50ºC durante 4 horas. Na Figura 31, observa-se que os
valores das intensidades de fluorescência são superiores a 50ºC comparativamente aos de 20ºC. Ao
longo do tempo a intensidade de fluorescência vai aumentando esperando obter-se um patamar, pois
a difusão de moléculas de

SRB pela membrana deveria aumentar, tal não acontece por a

concentração da solução de SRB utilizada ser elevada (10

-5

M). O efeito da temperatura na

membrana pode-se observar, por exemplo, aos 6000 s onde os valores da intensidade de

36

fluorescência a 50ºC são superiores aos de 20ºC. Esta diferença de intensidade, a diferentes
temperatura, poderá ocorrer devido à influência da temperatura na membrana alterando a porosidade
desta a 50ºC permitindo a passagem de mais moléculas de SRB. Caso não houvesse influência da
temperatura na membrana, esperava-se que os valores das intensidades de fluorescência a 20ºC
fossem superiores aos de 50ºC, pois com o aumento da temperatura há uma diminuição do
rendimento quântico. De forma a descontar esse efeito da temperatura no rendimento quântico, as
intensidades de fluorescência a 50ºC foram normalizadas, dividindo pela razão RI (Figura 31 B).

A

B

Figura 31 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (verde) e a 50ºC (azul) ao longo do
tempo (A). Com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 20ºC foram
normalizadas as intensidades de fluorescência a 50ºC, obtendo-se a curva a vermelho (B). As
intensidades de fluorescência foram medidas ao emi = 585 nm e exc=565 nm.

Nas nanopartículas de sílica mesoporosa com coroa polimérica (MSN-POLI) foi incorporada
sulforodamina B (MSN-SRB) como descrito no 3º Capítulo. Após a incorporação, prepararam-se dois
tubos de diálise, um com SRB em solução e outro com MSN-SRB e foi realizada uma cinética com
ciclos 50-20-50ºC para cada preparação. Inicialmente a temperatura foi de 50ºC, pois as
nanopartículas no final do processo de incorporação da SRB encontram-se a essa temperatura, onde
o polímero está colapsado e o núcleo carregado.

37

As intensidades de fluorescência, tanto para a SRB como para MSN-SRB foram normalizadas
para que as intensidades iniciais fossem iguais a zero. Na figura 32 (A), observou-se novamente a
influência da temperatura no rendimento quântico pois ocorreu variações de intensidade de
fluorescência para a SRB e MSN-SRB a 20ºC e a 50ºC, isto é, as intensidades de fluorescência dos
intervalos correspondentes a 50ºC são inferiores às intensidades de fluorescência a 20ºC assim, as
cinéticas foram corrigidas, dividindo os respectivos intervalos a 50ºC pela razão RI calculada
anteriormente.

A

B

Figura 32 - Variações de intensidade de fluorescência obtidas para a SRB (azul) e MSN-SRB (verde),
alterando a temperatura de 50 para 20ºC, de 20 em 20 minutos (A). As intensidades de fluorescência dos
intervalos correspondentes a 50ºC para a SRB (vermelho) e para as MSN-SRB (roxo) foram normalizadas
com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 20ºC (B). As intensidades de
fluorescência foram medidas ao emi = 585 nm e exc=565 nm.

Após a correcção das intensidades de fluorescência a 50ºC foram representados na Figura 33
os intervalos de tempo, para SRB e MSN-SRB a 20ºC e a 50ºC excluindo os valores de intensidade
de fluorescência das rampas. Os valores de intensidades nos intervalos de tempo foram ajustados
com uma recta tendo-se calculado os seus declives.

38

Figura 33 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (vermelho) e MSN-SRB a 20ºC (azul)
e intensidades de fluorescência normalizadas obtidas para a SRB a 50ºC (verde) e MSN-SRB a 50ºC (roxo)
e respectivos ajustes para cada intervalo. As intensidades de fluorescência foram medidas ao emi = 585
nm e exc=565 nm.

Dos ajustes (Figura 33), notou-se que o declive para a SRB e MSN-SRB a 20ºC se mantem
idênticos ao longo do tempo, contudo a 50ºC observam-se alterações nos declives. Esta diferença de
declives está relacionada com a libertação de SRB. A representação dos declives em função do
tempo (Figura 34), mostra que para a SRB livre os declives a 20ºC são semelhantes ao longo do
tempo (devido à difusão lenta de moléculas de SRB livres em solução pela membrana). A 50ºC o
declive referente a SRB livre não se alterou significativamente (embora sejam mais elevados que os
declives a 20ºC, devido ao aumento da porosidade da membrana com a temperatura). Os declives
das MSN-SRB a 20ºC foram idênticos durante a cinética o que era esperado, pois a 20ºC as cadeias
poliméricas estão hidratadas logo, o polímero está expandido, permitindo que as moléculas de SRB
difundam do núcleo da partícula para a coroa polimérica, mas ficando aí retidas. Pressupõe-se que o
aumento de intensidade a 20ºC se deve às moléculas de SRB livres em solução, contudo os declives
são constantes ao longo do tempo.
A observar os declives de MSN-SRB a 50ºC reparou-se que estes diminuem ao longo do
tempo. No primeiro intervalo, o declive é bastante elevado mostrando que ocorreu maior difusão de
moléculas de SRB pela membrana. A 50ºC, as cadeias poliméricas colapsam em torno da
nanopartícula e ficam mais hidrofóbicas havendo interacções preferenciais entre solvente-solvente e
polímero-polímero. Assim, as moléculas de SRB que se encontram na coroa polimérica são expelidas
provocando um aumento da concentração de SRB no tubo de diálise e em consequência, uma maior
difusão de moléculas de SRB pela membrana. A diminuição dos declives obtidos a 50ºC para as
partículas carregadas com SRB ao longo do tempo, sugere que as partículas foram descarregando o
seu conteúdo e desta forma a difusão de moléculas através da membrana de celulose foi menor. A
figura 34 mostra uma elevada libertação de moléculas a 50ºC para as MSN-SRB comparativamente
com SRB em todos os intervalos de tempo. A temperaturas baixas a libertação é pouco significativa.

39

Pondo isto, a coroa polimérica das MSNs híbridas possui um mecanismo que possibilita a libertação
controlada através da temperatura.

3000
SRB 50°C
MSN-SRB 50°C

2500

SRB 20°C

Decilve

2000

MSN-SRB 20°C

1500

1000

500

0
0-20 20°C
23-42
50°C

47-62
50°C

68-80
20°C

90-100
110-120 130-142
150-160 170-180
190-200
50°C 20°C
50°C 20°C
50°C 20°C

Intervalo tempo (min)

20 em 20 min
Figura 34 - Representação dos declives obtidos através dos ajustes efectuados para as variações da
intensidade de fluorescência da SRB (amarelo) e MSN-SRB (laranja) a 50ºC e para SRB (cinzento) e
MSN-SRB (azul) a 20ºC.

Na figura 35 está representado um esquema do comportamento das nanopartículas carregadas
com SRB. A quantidade de moléculas de SRB na nanopartícula foi diminuindo ao longo do tempo
devido à libertação de SRB que ocorreu quando se aumentou a temperatura. Inicialmente, a 50ºC, as
nanopartículas estavam completamente carregadas (Figura 35 A). Com a diminuição da temperatura
as cadeias poliméricas modificaram a sua conformação ficando mais hidrofílicas e permitindo a
migração de moléculas de SRB do núcleo da nanopartícula para a coroa polímerica que se encontra
expandida (Figura 35 B). Ao aumentar novamente a temperatura o polímero volta a colapsar,
libertando as moléculas presentes na coroa (Figura 35 C). A libertação de moléculas de SRB pelas
nanopartículas ocorre até as MSNs ficarem completamente descarregadas. Na célula (Figura 35)
observa-se um aumento progressivo da intensidade de fluorescência devido ao efeito cumulativo, no
entanto a difusão de SRB pela membrana de celulose vai diminuindo à medida que a SRB sai das
partículas para o meio aquoso.

40

No estudo realizado ocorreu maior libertação de moléculas de SRB a 50ºC nas MSN-SRB o
que demonstra que estas nanopartículas híbridas podem ser utilizadas para incorporar fármacos e
funcionarem como sistema de libertação controlada de resposta a temperatura.

A

B

C

D

Figura 35 - Esquema representativo do comportamento das MSN-POLI carregadas com a sulforodamina
B. O polímero a 50ºC encontra-se expandido (B e C) e a 50ºC colapsa (C e D) . A 50ºC a SRB presente na
coroa polimérica é libertada. Com a diminuição da temperatura, o polímero encontra-se novamente
expandido.

41

Conclusão

Este trabalho consistiu na síntese e caracterização de nanopartículas híbridas compostas por
um núcleo de sílica mesoporosa e um revestimento polimérico termossensivel. As nanopartículas
foram carregadas com sulforodamina B e testadas como sistemas de libertação controlada através
da temperatura.
As nanopartículas de sílica mesoporosas esféricas foram marcadas no interior com um
corante fluorescente derivado do perilenodiimida (PDI) e verificou-se que as propriedades do PDI
ligado covalentemente no interior da sílica não foram alteradas, pois os espectros de emissão e
excitação das nanopartículas de sílica com corante no interior em dispersão aquosa apresentam
forma similar aos espectros de emissão e excitação do PDI em etanol. As MSNs foram sujeitas a uma
modificação da superfície com APTES e um agente RAFT que permitiu realizar a polimerização dos
monómeros de PEG-acrilatos (OEGMA e MEO2MA) de forma controlada a partir da superfície das
nanopartículas de sílica. O tensiactivo foi removido e os poros incorporaram moléculas de SRB com
sucesso.
As nanopartículas de sílica foram caracterizadas por TEM e DLS obtendo diâmetros
semelhantes variando entre 140 a 210 nm. A caracterização por microscopia electrónica de
transmissão mostrou que as nanopartículas sintetizadas apresentaram mesoporos bem definidos e
nas nanopartículas híbridas observou-se a presença da coroa polimérica. O comportamento
termossensivel da coroa polimérica foi estudado por DLS onde se provou que as cadeia poliméricas
tem a capacidade de estender e colapsar em solução.
As MSNs híbridas foram estudadas como sistema de libertação controlada de moléculas de
SRB com a influência da temperatura. O aumento da temperatura acima da LCST induz a contracção
das cadeias de polímero e aumenta a difusão de SRB para a solução de tampão fosfato, observandose uma maior libertação de moléculas de SRB. Este estudo foi inovador visto que não se encontra na
literatura sistemas de libertação controlada de resposta a temperatura com o mecanismo descrito. O
estudo apresentado é uma prova de conceito que indica que estas nanopartículas híbridas são
excelentes candidatas a sistemas de libertação controlada com resposta a temperatura, com
potenciais aplicações no tratamento do cancro.
Os objectivos do trabalho foram alcançados, pois conseguiu-se sintetizar as nanopartículas
núcleo-coroa pretendidas e estudar o efeito da temperatura nas cadeias poliméricas. No seguimento
do trabalho apresentado, propõe-se o estudo da influência do tamanho das cadeias poliméricas na
libertação controlada de moléculas.

42

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