ARTIGO DE REVISÃO

Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte
alternativo
Bone bioengineering: collagenic matrix as an alternative scaffold
Esther Rieko TAKAMORI1, Ana Priscila Querino DEVEZA2, Silvana Rosa de Lima Ramos da SILVA2, Willian Fernando ZAMBUZZI3,
José Mauro GRANJEIRO4
1. Professora, Universidade do Grande Rio, Duque de Caxias, RJ, Brasil.
2. Graduanda em Odontologia, Universidade do Grande Rio, Duque de Caxias, RJ, Brasil.
3. Professor, Universidade do Grande Rio, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Pesquisador, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil.
4. Pesquisador Sênior, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Professor Adjunto do Núcleo de Terapia Celular, Hospital Universitário Antonio
Pedro, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.

Endereço para correspondência:
José Mauro Granjeiro
Avenida Nossa Senhora das Graças, 50
Prédio 6 ­ Sala da DIPRO ­ 1º. andar - Xerém
25250-020 ­ Duque de Caxias ­ Rio de Janeiro ­ Brasil
E-mail: [email protected]
Recebido: 30/11/2011
Aceito: 12/03/2012
RESUMO
O osso é um tecido altamente dinâmico e vascularizado capaz de se regenerar espontaneamente quando afetado em
pequenas lesões. A terapia de perdas ósseas extensas constitui um dos grandes desaos das áreas médicoodontológica e econômica. Apesar de o enxerto autógeno ainda ser considerado o "gold-standard", esta alternativa
apresenta limitações como a necessidade de um segundo sítio cirúrgico, limitação da quantidade/qualidade de osso
disponível e falta de previsibilidade. A bioengenharia surgiu como um campo promissor no tratamento de defeitos
ósseo críticos. O que se espera é que os materiais carreadores devem ser biocompatíveis, possibilitar a proliferação e
diferenciação dos tipos celulares desejados, além de apresentar baixo potencial em desencadear resposta imuneinamatória. Por se apresentar como um dos constituintes majoritários da matriz extracelular do tecido ósseo e pelo
grau de homologia estrutural dentre os vertebrados superiores, o colágeno vem sendo intensivamente investigado
como material carreador para células osteogênicas. Neste cenário, o objetivo desta revisão foi discutir avanços
obtidos na área da bioengenharia de tecidos, ponderando as matrizes colagênicas como carreadores biológicos.
Palavras-chave: Colágeno. Engenharia tecidual. Membranas.
ABSTRACT
Bone is a dynamic and highly vascularized tissue that can regenerate spontaneously when affected in minor injuries.
On the other hand, the therapy of extensive bone loss is a major challenge of medical and dental areas. Despite
autograft is still considered the "gold standard" in this field, there are limitations, sucha as: need for a second
surgical site; also, the quantity / quality is another point that deserves attention. In order to solve this issue,
bioengineering has emerged as a promising field in the treatment of bone defects. It is very known that the ideal
carrier should be biocompatible, allowing the proliferation and differentiation of desired cell types, and present low
potential to trigger immune-inflammatory response. By presenting itself as one of the major constituents of the
extracellular matrix of bone tissue and the degree of structural homology among the higher vertebrates, collagen has
been investigated as a material carrier for osteogenic cells. In this scenario, the objective of this review was to
discuss advances on tissue bioengineering, evaluating the potential use of collagen matrices as biological carriers
Keywords: Collagen. Tissue engineering. Membranes.

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Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte alternativo

INTRODUÇÃO
O comprometimento total ou parcial de um órgão
acarreta, além da perda da função, transtornos sociais
e, muitas vezes, psicológicos. Os avanços alcançados
na área da saúde, aliados ao aumento da expectativa de
vida, têm possibilitado o desenvolvimento de
ferramentas que possibilitam uma melhor qualidade de
vida. A disponibilidade dessas técnicas tem oferecido
novas opções aos pacientes mutilados, como a
substituição total ou parcial de ossos fraturados por
implantes.
Por outro lado, o produto destes recursos
tecnológicos acarretará em um crescimento
populacional potencialmente perigoso. A evolução do
perl demográco e social aponta para o aumento
progressivo da idade média das populações humanas
em todo o mundo. Principalmente com a faixa de
terceira idade, as doenças degenerativas representam
custos elevados de assistência médica18.
O número mundial de pacientes suscetíveis de
receber uma terapia ortopédica associada com
bioengenharia tem aumentado nos últimos anos,
afetando diretamente os gastos destinados a estas
intervenções54. A produção de biomateriais no Brasil é
ainda muito limitada e, em muitos casos, inexistente
(por exemplo, biopolímeros). O mercado nacional
médico-odontológico é dependente da importação, o
que limita o emprego destes materiais em larga escala e
aumenta os custos das cirurgias.
Tanto os processos degenerativos quanto as lesões
traumáticas exigem terapias que possam preservar,
melhorar e/ou restaurar suas funções teciduais.
Contrastando com outros avanços trazidos pela
biotecnologia, que podem ser usados indistintamente
por um grande número de pacientes, a medicina
regenerativa é particular. Trata-se, portanto, de uma
medicina individualizada, cuja ação envolve as
seguintes etapas, independentes ou associada:
1- Obtenção e manipulação ex vivo de células do
próprio paciente, seguidas em muitos casos da sua
expansão e diferenciação in vitro.
2- Reintrodução de células no corpo do paciente,
seguida da sua integração em tecidos regenerados e
funcionais (terapias celulares).
3- Desenvolvimento e produção de estruturas
ordenadas (biomateriais), e a sua implantação nas
regiões lesadas. Assim, procura-se propiciar in vivo a
formação de estruturas semelhantes aos elementos de
matriz extracelular e de mediadores intercelulares
associados, facilitando a mobilização, expansão e
integração de populações de células regenerativas
internas, fomentando o reparo de lesões ou de
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regeneração e renovação de tecidos degenerados
(biomimética, bioengenharia ou engenharia tecidual).
Por sua vez, a engenharia de tecidos é um termo
originalmente usado para descrever a produção de
tecido através de cultura de células cultivadas sobre
matrizes absorvíveis e porosas. Neste sentido, ainda,
tem-se buscado intensamente o carreador ideal para
esta nalidade. Dependendo do tipo da lesão, um fator
primordial que deve ser levado em conta é o tempo de
degradabilidade do material, uma vez que a formação
do tecido deve acompanhar sua degradação.
Por outro lado, recentes estudos têm mostrado que
vários tipos de células como os osteoblastos e préosteoblastos, podem proliferar e manter o seu fenótipo
quando mantidas in vitro, primariamente em substratos
bidimensionais, matrizes porosas tridimensionais e
géis66,69,71,75. Isto constitui uma das bases da engenharia
de tecidos que envolvem a implantação de matrizes
porosas isoladas ou associadas a células para auxiliar a
regeneração tecidual in vivo60.
Recentemente, no Brasil, algumas empresas vêm
trabalhando no desenvolvimento de tecnologia
nacional para a produção de biomateriais xenogênicos
com vistas a auxiliar o reparo ósseo e a regeneração
tecidual. Dentre os materiais em desenvolvimento há
membranas derivadas de osso desmineralizado e
liolizado45, do tendão7 e de pericárdio51, todos de
origem bovina.
Especicamente, o colágeno tem se mostrado
como uma importante alternativa para regeneração
tecidual guiada, sendo um dos materiais mais
utilizados. Isso se deve a sua excelente
biocompatibilidade e segurança, somados às suas
características biológicas como biodegrabilidade30,66.
Neste cenário, o Brasil ocupa uma posição de destaque
por possuir um dos maiores rebanho bovino do mundo.
No entanto, maiores investimentos, somados a
proximidade indústria/universidade, trariam
benefícios à economia brasileira, além de baratear o
custo despendido pelos recursos públicos a estes
problemas sociais.

REVISÃO DE LITERATURA
TRATAMENTO DE PERDAS ÓSSEAS: DO
ENXERTO AUTÓGENO A BIOENGENHARIA
DE TECIDOS
Perdas ósseas signicativas podem ocorrer em
função de acidentes e/ou patologias como cistos ou
tumores. Dependendo da extensão, da localização e
das características da lesão, o organismo consegue

ARTIGO DE REVISÃO

Takamori ER, Deveza APQ, Silva SRLR, Zambuzzi WF, Granjeiro JM

regenerar o tecido ósseo lesado. Entretanto, em
defeitos ósseos extensos ou perenes, o organismo
consegue apenas reparar o local com um tecido broso
que não é compatível com a função siológica e
estrutural do tecido ósseo, comprometendo seu
funcionamento39,62.
Neste sentido, vários tratamentos têm sido
propostos para auxiliar a regeneração óssea. Como
mencionado anteriormente, o enxerto autógeno é o
material utilizado normalmente, apresentando os
melhores resultados. Nesse tipo de tratamento, obtémse tecido ósseo do próprio paciente, tendo como área
doadora, frequentemente, a região da crista ilíaca e, em
alguns casos de cirurgias orais, as regiões do túber da
maxila, retromolar e mentoniana. Este material
apresenta vantagens como ausência de resposta imune
e a possibilidade de se levar células osteoprogenitoras,
juntamente com fragmentos ósseos que atuam como
condutores das células de reparo para o tecido lesado38.
Entretanto, existem desvantagens na utilização desse
tratamento, como: 1) limitação da quantidade e
qualidade do tecido a ser removida, 2) a necessidade de
um segundo sítio cirúrgico, 3) o pós-operatório
desagradável, 4) a morbidade, 5) o custo da internação,
6) possibilidade da ocorrência de sequelas24,46-47,76.
Como alternativa ao enxerto autógeno, tem-se
utilizado os enxertos alógenos, obtidos de doadores da
mesma espécie. Não possuem células
osteoprogenitoras, mas têm capacidade de
osteoindução e osteocondução. Este material possui
características próximas às do tecido do paciente a ser
tratado, além de maior facilidade de obtenção do que o
enxerto autógeno, sem a necessidade de um segundo
sítio cirúrgico no mesmo paciente. Porém, existe a
possibilidade de resposta imune e transmissão de
doenças como AIDS e hepatite, por exemplo, sendo
necessário um controle rigoroso, além de um
tratamento adequado desse tipo de enxerto52 . A
utilização de enxertos alógenos exige, ainda, a
existência de um banco de ossos, cuja manutenção
demanda um grande custo26.
Diante dos inconvenientes apresentados tanto pelo
enxerto autógeno como pelo enxerto alógeno, muitos
cientistas pesquisam biomateriais alternativos e novas
estratégias de tratamento que possam auxiliar a
regeneração do tecido ósseo 11 , 2 1 , 5 6 , 5 9 , 7 2 - 7 4 . Esses
biomateriais podem ser classicados em aloplásticos
ou xenogênicos. Nosso grupo tem investigado
características físico-químicas1 e respostas biológicas
de materiais xenogênicos de origem bovina73-74
utilizando modelos biológicos in vivo e, mais
recentemente, temos utilizado modelos in vitro. A
utilização de recursos in vitro, além de apresentar uma
maior facilidade de manuseio, diminui o uso de
animais de laboratório, fato esse bastante discutido nos

últimos anos por ONGs ativistas.
A despeito de suas propriedades os materiais
aloplásticos e xenogênicos podem ser associados com
moléculas sinalizadoras, as quais garantem uma
melhor atividade de células osteoprogenitoras46. Estas
moléculas funcionam como estímulos e são,
principalmente, fatores de crescimento, como as
BMPs22.
As células, bem como os produtos de sua
atividade, constituem um fator essencial para a
construção e remodelamento de qualquer tecido. Um
tratamento baseado na utilização de células do próprio
paciente, levadas ao sítio da lesão sobre um
biomaterial começou a ser desenvolvido. Assim surgia
um novo e promissor campo: a engenharia de tecidos34.
BIOENGENHARIA: CONSTRUINDO TECIDOS
IN VITRO
Dessa maneira, a engenharia de tecidos surgiu
como consequência da combinação dos princípios de
engenharia, química e biologia, para o
desenvolvimento de substitutos naturais que
permitisse restaurar, manter ou melhorar a função dos
tecidos29,42. As estratégias da engenharia de tecidos
envolvem o uso de células isoladas, associadas ou não
com fatores de crescimento, crescidas sobre
carreadores50,64.
Matrizes porosas isoladas ou associadas a células
têm sido empregadas na regeneração tecidual in
vivo 25,60 . Estes trabalhos iniciais motivaram o
desenvolvimento de potenciais carreadores e
processos de cultivo celular para aperfeiçoar o cultivo
de células osteoprogenitoras capazes de se
diferenciarem em osteoblastos. Osteoblastos são
células ósseas responsáveis pela formação do tecido
ósseo. Atualmente, outro enfoque que temos abordado
é a investigação dos mecanismos moleculares que
governam os eventos de adesão e diferenciação de
osteoblastos, com o intuito de conhecer ainda mais
sobre estes mecanismos71,75.
Atualmente, os avanços nas técnicas de biologia
celular e molecular permitiram o cultivo ex vivo de
uma diversidade de células, dentre elas as
osteogênicas 6 7 , 7 0 que, aderidas a carreadores
adequados, podem ser implantadas em defeitos
extensos, promovendo sua regeneração sem danicar
o tecido ósseo normal e saudável.
As técnicas de engenharia de tecidos são baseadas
em carreadores tridimensionais porosos com baixo
potencial em estimular reações de corpo estranho,
além de taxas de biodegradação controladas para
permitir que células do hospedeiro se espalhem e
proliferem sobre o material, promovendo a
reconstrução dos tecidos. Devem ainda apresentar
habilidade para interagir in situ com células residentes
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Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte alternativo

na borda da lesão, para induzir regeneração e a
osteointegração do material5,8.
Diante da necessidade em se obter bons
carreadores celulares, pesquisas têm sido realizadas
para o desenvolvimento de biomateriais que possam
desempenhar esta função. Esses biomateriais, além de
serem biocompatíveis, osteoindutores e
osteocondutores, devem ser capazes de facilitar a
revascularização, promovendo assim um ambiente que
possa guiar a neoformação óssea12,35. Neste caso a
angiogênese garantirá o sucesso da regeneração
tecidual, uma vez que oferecerá suporte de nutrientes e
troca de gases entre as células e uídos corpóreos no
centro da lesão, indispensáveis para suas atividades
metabólicas vitais.
Apesar de materiais sintéticos, tais como
poliésteres derivados de alfa-hidroxi-ácidos e outros
polímeros, apresentarem vantagens como exibilidade
e arquitetura, eles não estão livres de reações adversas
indesejáveis, como sua cinética de biodegradação e
liberação de produtos locais 21. Outra classe de
biomateriais para a reconstrução de tecido ósseo está
relacionada com o uso de biomiméticos, que procuram
mimetizar características dos tecidos naturais do
indivíduo. Estes englobam polímeros sintéticos e
naturais, com ou sem a adição de moléculas para
sinalização celular. Entre os polímeros naturais, o
colágeno desperta um interesse especial devido a sua
alta biocompatibilidade e homologia estrutural5,49.
Os carreadores tridimensionais têm função análoga
ao da matriz extracelular, agindo como uma estrutura de
suporte físico-mecânico e como um regulador insolúvel
da atividade biológica que afeta processos celulares tais
como migração, proliferação e diferenciação.
Fisiologicamente, o colágeno é o constituinte
majoritário da matriz extracelular (MEC) e a partir
disso, carreadores colagênicos têm sido utilizados numa
variedade de aplicações biológicas. Este interesse se
deve, ainda, por uma série de características:
propriedades hemostáticas, baixa antigenicidade e
propriedades mecânicas adequadas5,30-31,44.
AVA L I A Ç Ã O D E M AT E R I A I S C O M O
CARREADORES PARA ENGENHARIA DE
TECIDOS
Antes da utilização de novos biomateriais in vivo
ou mesmo na clínica, eles precisam ser avaliados por
meio de ensaios in vitro utilizando, por exemplo, as
n o r m a s d a I n t e r n a t i o n a l O rg a n i z a t i o n f o r
Standardization (ISO 10993-5)27. O regimento destas
normas garante uma melhor aceitabilidade do material
avaliado, bem como direciona, de forma racional, o
uso de animais destinados a análises in vivo. Testes
biológicos bem aceitos para análises de
biocompatibilidade e adesão celular in vitro são:
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redução de MTT41 e Cristal Violeta10. Posteriormente,
testes de diferenciação celular também podem ser
confeccionados. Por outro lado, outro fator de
determinação será a análise de seu potencial
inamatório. Isto pode ser realizado por meio da
interação de macrófagos com material avaliado,
vericando-se a produção de citocinas próinamatórias, como interleucinas (ILs) e interferons
(IFNs)19. Abaixo, detalhamos alguns destes aspectos:
Potencial inamatório: Pesquisas têm mostrado
que há uma importante interação entre biomateriais e o
sistema imune. O reconhecimento dos biomateriais
como antígenos estimula a reações de defesa do
organismo, tais como inamação, expressão de
anticorpos, ativação do sistema complemento e
liberação de citocinas 2 , 3 2 . Quando ativados,
macrófagos secretam uma série de mediadores
inamatórios. Um macrófago se torna ativado em
resposta aos produtos microbianos, complexos
imunes, mediadores químicos e certas proteínas de
matriz celular e citocinas produzidas por linfócitos T.
Os macrófagos ativados são capazes de secretar um
largo número de citocinas, tais como IL-1; IL-6; IL-10;
IL-12; IL-18. TNF-alfa, TGF-beta, IL-18 e MP-10.
Inicialmente, os macrófagos se aderem/ativam a
superfície de biomateriais com o intuito de fagocitá-lo.
A secreção subsequente de citocinas direciona as
repostas inamatória e cicatricial desencadeadas pelo
biomaterial3.
Os macrófagos ativados inibem a replicação de
patógenos pela liberação de uma variedade de
moléculas efetoras, dentre elas, o NO (óxido nítrico),
que regula a função, proliferação e morte de muitas
células do sistema imune e anti-inamatório, dentre
elas os linfócitos T, células apresentadoras de
antígenos, mastócitos, neutrólos e células natural
Killer61.
A produção de espécies reativas ao óxido nítrico
(NO), por macrófagos RAW 264.7 (ATCC) foi
avaliada em contato com nanopartículas de ouro, por
meio da determinação da determinação de nitrito,
método indireto para se quanticar NO, e vericaram
uma redução dose e tempo dependente dessa molécula.
Esse resultado indicou que as nanopartículas de ouro,
exerceram, direta ou indiretamente, efeitos
antioxidantes nos macrófagos55.
Avaliou-se a biocompatibilidade in vitro de
biomateriais por meio da determinação da resposta
imune ao mesmo. Macrófagos intraperitoneais de ratos
foram estimulados com PTE, PLGA, NPG e beta-TCP.
Vericou-se que os macrófagos estimulados com PTFE
produziram mais TNF- e IL-1 que os não estimulados
e os outros materiais induziram resposta moderada20.
Desde que a biocompatibilidade é reduzida
quando biomateriais induzem altas quantidades de

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citocina, a sua indução pode ser usada para avaliar a
intensidade da reação imune em reação a um
biomaterial77.
Como discutido anteriormente, o osso é um tecido
dinâmico e que está em constante remodelamento,
onde a reabsorção e a deposição óssea estão em
constante equilíbrio siológico. Quando uma
inamação crônica ocorre, esse balanço é
interrompido em favor da perda óssea36,77. Citocinas
inamatórias, tais como IL-1 e IL-1, fator de
necrose tumoral (TNF-)65 e IL-1768 têm demonstrado
afetar o metabolismo ósseo.
Adesão e diferenciação celular: Os estudos de
adesão celular podem utilizar osteoblastos
provenientes de cultura primária ou linhagens
celulares estabelecidas, de diferentes origens (osso
longo, calvária, periósteo, medula óssea) e de
diferentes espécies (humana, rato, camundongo)17. As
linhagens estabelecidas rotineiramente usadas são:
MC3T3-E148, hFOB15, FOST6, MG6323.
A adesão inicial das células aos materiais é
necessária para a subsequente proliferação e expressão
do seu fenótipo, conseguida totalmente pelos eventos
de diferenciação13,66. O processo de adesão celular é
dependente de sua maquinaria de ancoragem à
superfície de materiais, tornando-se como um prérequisito para os eventos de transcrição e tradução. No
tecido ósseo, o tipo celular predominante que interage
com as superfícies é o osteoblasto. A interação destas
células com as superfícies dos materiais tem efeitos
profundos sobre muitos processos biológicos,
incluindo adesão, migração, proliferação, e
diferenciação fenotípica14,37.
As diferenças nas características de superfície de
um material levavam a diferenças nas taxas de
proliferação, na morfologia e na adesão de
osteoblastos (MC3T3-E1) na superfície dos mesmos.
Nos materiais que apresentavam superfície mais lisa,
observou-se menor adesão dos pré-osteoblastos e uma
maior taxa de proliferação33. As superfícies de titânio
com diferentes rugosidades foram avaliadas e
observou-se que as células osteoprogenitoras FOST
apresentaram maior taxa de proliferação e
diferenciação nas superfícies mais lisas53.
Fisiologicamente, os osteoblastos sintetizam a
matriz orgânica, constituída principalmente de
colágeno tipo I, que posteriormente é mineralizada por
eles próprios. Assim, os estágios iniciais da formação
óssea podem ser assim divididos: 1) tem-se um
aumento da expressão de colágeno tipo I e de fosfatase
alcalina; 2) na fase de mineralização, observa-se uma
maior quantidade de fosfato e cálcio, decorrente desse
processo. O aumento na concentração desses íons
inorgânicos pode ser determinado pelos métodos
experimentais, tais como Von Kossa9 e Alizarina57.

Além disso, podem-se quanticar, por meios
colorimétricos, os níveis de cálcio e/ou fósforo ao
longo do processo de mineralização16,69.
COLÁGENO: ALGUNS CONCEITOS
O colágeno é a proteína estrutural mais abundante
na matriz extracelular. Mais de 20 tipos distintos de
colágeno foram identicados até os dias atuais. O
principal colágeno estrutural nos tecidos de mamíferos
é o colágeno tipo I, mas outros, em menor quantidade e
distribuição também merecem destaque, como o
colágeno tipo III e IV. O tecido calagênico é,
principalmente, sintetizado por broblastos residentes
e ancorados na MEC, os quais se originam de células
adventícias pluripotentes ou células reticulares.
A molécula de colágeno consiste de 3 cadeias
polipeptídicas entrelaçadas, formando uma estrutura
em tripla-hélice. Cada cadeia polipeptídica possui
aproximadamente 1038 resíduos de aminoácidos. A
estrutura da tripla hélice é permitida devido a uma
sequência de aminoácidos repetitiva chamada (Gly-XZ)n onde Gly é glicina, X frequentemente prolina e Z
hidroxiprolina (Hyp). Para a molécula de colágeno do
tipo I, duas cadeias são idênticas, denominadas alfa-1,
a terceira é homóloga, mas quimicamente distinta,
denominada alfa-258. Durante a síntese de colágeno a
prolina é hidroxilada ainda no Complexo de Golgi
(organela celular), e a vitamina C é uma coenzima
desta catálise.
O colágeno tem sido bem caracterizado nos reinos
vegetal e animal63. A partir disso, tem se observado que
esta proteína tem mantido uma sequência de
aminoácidos altamente conservada no curso da
evolução das espécies. Esta homologia
conservacionista tem colocado o colágeno tipo I, de
origens alogênica e xenogênica, como potencial
carreador celular, aplicável para o reparo tecidual,
apresentando baixo potencial antigênico. O colágeno
tipo I bovino talvez seja o carreador biológico mais
utilizado para aplicações terapêuticas devido a sua
origem abundante e ao seu histórico de sucesso5.
A Figura 1 traz algumas características
microscópicas da matriz colagênica de origem bovina.

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Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte alternativo

Figura 1 - Matrizes colagênicas obtidas a partir de
pericárdio bovino. A) Microscopia eletrônica de varredura
(MEV) de um corte transversal. Note o arranjo
biologicamente orquestrado das bras de colágeno. B)
MEV mostrando a interação célula/matriz. Note que
osteoblastos cultivados sobre membranas de colágeno
apresentam características morfológicas distintas, como o
espraiamento (do inglês, spreading) e o lançamento de
prolongamentos. Fisiologicamente, estes prolongamentos
citoplasmáticos são importantes eventos que garantem a
comunicação célula/célula, a qual é essencial para o
controle da taxa proliferativa e maturação celular. C)
Microscopia óptica de um corte histológico transversal,
corado com hematoxilina & eosina, mostrando a camada de
células (F-OST, setas) cultivadas sobre a matriz de
colágeno in vitro.

COLÁGENO POLIANIÔNICO
Biomateriais a base de colágeno polianiônico
acelular foram então desenvolvidos a partir de
colágeno tipo I presente no pericárdio de origem
bovina, submetidos à hidrólise seletiva e controlada de
resíduos de carboxiamidas da asparagina e glutamina,
promovida por condições alcalinas em soluções
dimetil sulfóxido, na presença de sais, bases e metais
alcalinos. O aumento dos grupos carboxílicos foi
diretamente relacionado com o tempo de hidrólise.
Apesar da estrutura em tripla hélice dos materiais
polianiônicos serem preservadas em todos os casos,
um decréscimo na estabilidade termal e uma perda
gradual das moléculas de colágeno em formar brilas
foram detectados com o aumento do conteúdo de
carboxilas, provavelmente como resultado das
mudanças no padrão de interação eletrostática.
Os materiais resultantes formam basicamente
matrizes de colágeno polianiônico associadas com
conteúdo de elastina dependente do tempo de
hidrólise7. Os materiais submetidos à hidrólise por 24h
mostraram boa preservação da estrutura colagênica. A
habilidade do colágeno polianiônico em formar brilas
é inibida progressivamente com o aumento do
conteúdo de grupos carboxílicos, com completa
inibição observada após 72h de hidrólise7.
Um método de preparo do colágeno aniônico em
pH siológico, com pequenas alterações das estruturas
químicas, é a hidrólise seletiva dos grupamentos
carboxiamidas de resíduos dos aminoácidos asparagina
e glutanina, presentes na cadeia alfa do tropocolágeno.
Como resultado, enquanto na molécula de colágeno
nativo as cargas positivas e negativas estão distribuídas
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em raios de 250 nm, após a hidrólise das carboxiamidas,
um aumento da densidade de cargas negativas é
estabelecida na região central da molécula28.
Membranas de colágeno aniônico, obtidas a partir
de pericárido bovino, já foram caracterizadas em
termos morfológicos (microscopia de luz e eletrônica
de varredura), quanto à estabilidade térmica e quanto
ás suas características físico-químicas por análise em
FTIR7. Avaliou-se sua citotoxicidade e a possibilidade
de adesão celular. Para testes de citotoxicidade, células
foram tratadas com extratos obtidos de colágeno
aniônico e nativo8. Os resultados não mostraram sinais
de citotoxicidade em nenhum dos materiais avaliados,
mas foi observada adesão maior no material aniônico,
atribuída a alterações na estrutura colagênica que
possibilitaram um maior reconhecimento celular,
possivelmente intermediado por proteínas
transmembranas conhecidas como integrinas.
Adicionalmente, este material aniônico foi
mineralizado in vivo em um processo similar ao
siológico, sugerindo não somente seu
comportamento biomimético como a possibilidade de
carreador para a reconstrução de tecidos ósseos21.
Adicionalmente, avaliaram o potencial
osteogênico de membranas colagênicas de pericárdio
bovino, submetidas à 24h e 48h de hidrólise. Foram
plaqueadas células osteoprogenitoras fetais humanas
(hFOB 1.19) sobre as membranas colagênicas
aniônicas e vericou-se que as membranas colagênicas
hidrolisadas por 48h apresentaram os melhores e mais
promissores resultados em relação ao processo de
mineralização in vitro, avaliados pela atividade de
fosfatase alcalina (ALP), um biomarcador da
diferenciação e maturação de osteoblastos40.

DISCUSSÃO
No mercado médico-industrial, o colágeno é
largamente usado como matéria-prima para a
manufatura de biomateriais. Na maioria dos casos,
modicações químicas são realizadas para o
tratamento de tecidos ou materiais reconstituídos de
gel de colágeno com reagentes de cross-linkings para
aumentar sua biocompatibilidade, bem como suas
propriedades mecânicas. Outras mudanças químicas
incluem: estericação, acilação, desaminação do
grupo amino da lisina e bloqueando grupo guanidina
dos resíduos de arginina. Os materiais resultantes são
matrizes de colágeno carregadas usadas como suporte
para o crescimento celular, géis de colágeno para a
substituição do humor vítreo e para drug/gene

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delivery7. Dentre estes, o drug/gene delivery reveste-se
de grande interesse para a indústria farmacêutica,
podendo carrear diferentes fármacos em diferentes
situações. A obtenção de novos biomateriais a partir de
outros já conhecidos constitui-se numa alternativa
rápida e de baixo custo. Muitas vezes trata-se apenas
de pequenas modicações na superfície, através de
inserção de grupamentos químicos, remoção ou, ainda,
a confecção de diferentes topograas.
Dentre os diferentes tipos de colágeno, o colágeno
tipo I permite que sua estrutura seja modicada,
utilizando-se técnicas relativamente simples. Por meio
de um tratamento alcalino, por exemplo, um colágeno
aniônico com propriedades pizoelétricas aumentadas
pode ser obtido por meio de hidrólise dos grupos
carboxiamidas de resíduos de asparagina e glutamina.
Esse processo, aplicado ao colágeno de pericárdio
bovino, promove a obtenção de uma estrutura
semelhante a uma esponja, com poros de tamanho
heterogêneo e completa remoção das células
intersticiais43,49.

CONCLUSÃO
Diferentes condições patológicas ou traumáticas do
tecido ósseo têm despertado um maior interesse nos
últimos anos, devido principalmente ao aumento da
expectativa de vida. Reparo de lesões extensas causadas
por ressecção de tumores, infecções ou traumas
mecânicos, são situações onde geralmente ocorre perda
substancial do tecido ósseo e, com frequência,
necessitam de intervenção cirúrgica para seu
preenchimento com material autógeno. Além de outras
peculiaridades, nem sempre há qualidade e quantidade
de material autógeno disponível. Neste sentido, a
bioengenharia óssea é um campo de pesquisa fascinante
e que vem ganhando merecido destaque nos últimos
anos, principalmente aliado ao avanço tecnológico.
A possibilidade de se coletar células do
hospedeiro, cultivá-las, expandi-las ex vivo (em
laboratório), e depois devolvê-las ao paciente
caracteriza-se uma substancial mudança dentro da
prática clínica-reconstrutiva. Não obstante, o
desenvolvimento do osso "bio-engenheirado" tem o
potencial de impactar a prática clínica, principalmente
aos pacientes com reduzida capacidade curativa por
causa da idade, osteoporose ou outros distúrbios
metabólicos. Para este m, salientamos que matrizes
colagênicas de origem bovina apresentam
características decisivas para um bom carreador, como
é o caso de propriedades físico-químicas adequadas, as

quais são amplamente reetidas às respostas
biológicas. Considerando sua fonte a partir de bovinos,
o Brasil destaca-se pelo grande rebanho e oferta da
matéria-prima, o que o coloca em destaque no cenário
mundial. Sendo assim, políticas públicas de
conscientização e incentivo scal, aliado a uma maior
proximidade entre universidades e empresas, são
requeridas para um melhor aproveitamento e
otimização de processamento deste material biológico,
quase sempre desperdiçado ou mal utilizado.

REFERÊNCIAS
1. Accorsi-Mendonça T, Conz MB, Barros TC, Sena
LA, Soares GA, Granjeiro JM. Physicochemical
characterization of two deproteinized bovine
xenografts. Braz Oral Res. 2008;22(1):5-10.
2. Ahluwalia A, Basta G, Ricci D, Francesconi R,
Domenici C, Grattarola M, et al. LangmuirBlodgett lms of antibodies as mediators of
endothelial cell adhesion on polyurethanes. J
Biomater Sci Polym Ed. 1999;10:295-304.
3. Anderson JM, Rodriguez A, Chang DT. Foreign
body reaction to biomaterials. Semin Immunol.
2008;20:86-100.
4. Badylak SF. The extracellular matrix as a scaffold
for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol.
2002;13:377-83.
5. Badylak SF. Regenerative medicine and
developmental biology: the role of the extracellular
matrix. Anat Rec (part B: New Anat).
2005;287B:36-41.
6. Balduino A, Hurtado SP, Frazão P, Takiya CM,
Alves LM, Nasciutti LE, et al. Bone marrow
subendosteal microenvironment harbours
functionally distinct haemosupportive stromal cell
populations. Cell Tissue Res. 2005;319:255-66.
7. Bet MR, Goissis G, Lacerda CA. Characterization
of polyanionic collagen prepared by selective
hydrolysis of asparagines and glutamine
carboxyamide side chains. Biomacromolecules.
2001;2(4):1074-9.

Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:59-69.

65

Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte alternativo

8. Bet MR, Goissis G, Vargas S, Selistre-De-Araujo
HS. Cell adhesion and cytotoxicity studies over
polyanionic collagen surfaces with variable
negative charge and wettability. Biomaterials.
2003;24:131-7.

17. Declercq HA, Verbeeck RM, De Ridder LI,
Schacht EH, Cornelissen MJ. Calcication as an
indicator of osteoinductive capacity of
biomaterials in osteoblastic cell cultures.
Biomaterials. 2005;26:4964-74.

9. Bills CE, Eisenberg H, Pallante SL. Complexes of
organic acids with calcium phosphate: the von
Kossa stain as a clue to the composition of bone
mineral. Johns Hopkins Med J. 1971;128:194-207.

18. Departamento de Informática do SUS [Internet].
Brasília: Ministério da Saúde. c2013 ­ [cited 2011
M a y 1 0 ] . Av a i l a b l e f r o m :
http://www2.datasus.gov.br/DATASUS/index.php

10. Brasaemle DL, Attie AD. Microelisa reader
quantitation of xed, stained, solubilized cells in
microtitre dishes. Biotechniques. 1988;6:418-9.

19. Ding T, Sun J, Zhang P. Immune evaluation of
biomaterials in TNF-alfa e IL-1beta at mRNA
level. J Mater Sci: Mater Med. 2007;18:2233-6.

11. Burg KJ, Porter S, Kellam JF. Biomaterial
developments for bone tissue engineering.
Biomaterials. 2000;21(23):2347-59.

20. Felder CB, Vorlaender N, Gander B, Merkle HP,
Bertschinger HU. Microencapsulated
enterotoxigenic Escherichia coli and detached
mbriae for peroral vaccination of pigs. Vaccine.
2000;19:706-15.

12. Corden TJ, Jones IA, Rudd CD, Christian P,
Downes S, McDougall KE. Physical and
biocompatibility properties of poli-caprolactone
produced induzing in situ polymerization: a novel
manufacturing technique for long-bre composite
materials. Biomaterials. 2000;21:713-24.
13. Dalby MJ, Di Silvio L, Harper EJ, Boneld W. In
vitro adhesion and biocompatibility of osteoblastlike cells to poly(methylmethacrylate) and
poly(ethylmethacrylate) bone cements. Journal of
Materials Science: Materials in Medicine.
2002;13:311-4.
14. Datta N, Holtorf HL, Sikavitsas VI, Jansen JA,
Mikos AG.. Effect of bone extracellular matrix
synthesized in vitro on the osteoblastic
differentiation of marrow stromal cells.
Biomaterials. 2005;26:971-7.
15. de Souza Malaspina TS, dos Santos CX,
Campanelli AP, Laurindo FR, Sogayar MC,
Granjeiro JM. Tartrate-resistant acid phosphatase
activity and glutathione levels are modulated
during hFOB 1.19 osteoblastic differentiation. J
Mol Histol. 2008;39:627-34.
16. Declercq H, Van den Vreken N, De Maeyer E,
Verbeeck R, Schacht E, De Ridder L, et al. Isolation,
proliferation and differentiation of osteoblastic cells
to study cell/biomaterial interactions: comparison of
different isolation techniques and source.
Biomaterials. 2004;25:757-68.

66

Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:59-69.

21. Goissis G, Silva Maginador SV, Conceição Amaro
Martins V. Biomimetic mineralization of charged
collagen matrices: in vitro and in vivo study. Artif
Organs. 2003;27(5):437-43.
22. Granjeiro JM, Oliveira RC, Bustos-Valenzuela JC,
Sogayar MC, Taga R. Bone morphogenetic
proteins: from structure to clinical use. Braz J Med
Biol Res. 2005;38(10):1463-73.
23. Hélary G, Noirclère F, Mayingi J, Migonney V. A
new approach to graft bioactive polymer on
titanium implants: Improvement of MG 63 cell
differentiation onto this coating. Acta Biomater.
2009;5:124-33.
24. Hierholzer C, Sama D, Toro JB, Peterson M, Helfet
DL. Plate xation of ununited humeral shaft
fractures: effect of type of bone graft on healing. J
Bone Joint Surg Am. 2006;88(7):1442-7.
25. Hollister SJ. Porous scaffold design for tissue
engineering. Nature Materials. 2005;4:518-24.
26. Holmquist P, Dasmah A, Sennerby L, Hallman M.
A new technique for reconstruction of the
atrophied narrow alveolar crest in the maxilla using
morselized impacted bone allograft and later
placement of dental implants. Clin Implant Dent
Relat Res. 2008;10(2):86-92.

ARTIGO DE REVISÃO

Takamori ER, Deveza APQ, Silva SRLR, Zambuzzi WF, Granjeiro JM

27. International Organization for Standardization.
ISO 10993-5. Biological evaluation of medical
devices - part 5: tests for in vitro cytotoxicity.
Geneva: The Organization; 1996.
28. Lacerda C, Plepis AMG, Goissis G. Hidrólise
seletiva de carboxiamidas de resíduos de asparagina
e glutamina em colágeno: preparação e
caracterização de matrizes aniônicas para uso como
biomateriais. Química Nova. 1998;21:267-71.
29. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science.
1993;260(5110):920-6.
30. Lee CH, Singla A, Lee Y. Biomedical applications
of collagen. Int J Pharm. 2001;221(1-2):1-22.
31. Lee SJ, Kim SY, Lee YM. Preparation of porous
collagen/hyaluronic acid hybrid scaffolds for
biomimetic functionalization through biochemical
binding afnity. J Biomed Mater Res B Appl
Biomater. 2007;82:506-18.
32. Li Y, Schutte RJ, Abu-Shakra A, Reichert WM.
Protein array method for assessing in vitro
biomaterial-induced cytokine expression.
Biomaterials. 2005;26:1081-5.
33. Linez-Bataillon P, Monchau F, Bigerelle M,
Hildebrand HF. In vitro MC3T3 osteoblast
adhesion with respect to surface roughness of
Ti6Al4V substrates. Biomol Eng. 2002;19:133-41.
34. Luyten FP, Dell'Accio F, De Bari C. Skeletal tissue
engineering: opportunities and challenges. Best
Pract Res Clin Rheumatol. 2001;15(5):759-69.
35. Ma PX. Biomimetic materials for tissue
engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60:184-98.
36. Menezes R, Bramante CM, da Silva Paiva KB,
Letra A, Carneiro E, Zambuzzi WF, et al. Receptor
activator NFkappaB-ligand and osteoprotegerin
protein expression in human periapical cysts and
granulomas. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod. 2006;102:404-9.
37. Meyer U, Meyer T, Jones DB. Atachments kinets,
proliferation rates and vinculin assembly of bovine
osteoblasts cultured on different pre-coated
articial substrates. J Mater Sci Mater Med.
1998;9:301-7.

38. Misch CE, Dietsh F. Autogenous bone grafts for
endosteal implants-indications and failures. Int J
Oral Implantol. 1991;8(1):13-20.
39. Misch CE, Dietsh F. Bone-grafting materials in
implant dentistry. Implant Dent. 1993;2(3):158-67.
40. Moreira PL. In vitro analysis of anionic collagen
scaffolds for bone repair. J Biomed Mater Res Part
B: Appl Biomater. 2004;71B:229-37.
41. Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular
growth and survival: application to proliferation
and cytotoxicity assays. J Immunol Methods.
1983;65:55-63.
42. Nerem RM. Tissue engineering in the USA. Med
Biol Eng Comput. 1992;30(4):CE8-12.
43. Noris-Suárez K, Lira-Olivares J, Ferreira AM,
Feijoo JL, Suárez N, Hernández MC, et al. In vitro
deposition of hydroxyapatite on cortical bone
collagen stimulated by deformation-induced
piezoelectricity. Biomacromolecules. 2007;8:941-8.
44. O'Brien FJ, Harleyc BA, Yannasc D, Gibsona LJ.
The effect of pore size on cell adhesion in collagenGAG scaffolds. Biomaterials. 2005;26:433-41.
45. Oliveira RC, Carneiro E, Cestari TM, Taga R,
Granjeiro JM. Dynamics of subcutaneous tissue
response to the implantation of tetracycline-treated
or untreated membrane of demineralized bovine
cortical bone in rats. J Biomater Appl.
2006;21(2):167-78.
46. Oreffo RO, Trift JT. Future potencials for using
osteogenic stem cells and biomaterials in
orthopedics. Bone. 1999;25(Suppl 2):5S-9S.
47. Peelle MW, Rawlins BA, Frelinghuysen P. A novel
source of cancellous autograft for ACDG surgery:
t h e m a n u b r i u m . J S p i n a l D i s o r d Te c h .
2007;20(1):36-41.
48. Quarles LD, Yohay DA, Lever LW, Caton R,
Wenstrup RJ. Distinct proliferative and
differentiated stages of murine MC3T3-E1 cells in
culture: an in vitro model of osteoblast
development. J Bone Miner Res. 1992;7:683-92.
49. Rocha LB, Goissis G, Rossi MA. Biocompatibility
of anionic collagen matrix as scaffold for bone
healing. Biomaterials. 2002;23:449-56.

Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:59-69.

67

Bioengenharia óssea: matrizes colagênicas como suporte alternativo

50. Roether JA, Gough JE, Boccaccini AR, Hench LL,
Maquet V, Jérôme R. Novel bioresorbable and
bioactive composites based on bioactive glass and
polylactide foams for bone tissue engineering. J
Mater Sci Mater Med. 2002;13(12):1207-14.

60. Spector M. Basic principles of tissue engineering.
In: Lynch SE, Genco RJ, Marx RE. Tissue
engineering: applications in maxillofacial surgery
and periodontics. Chicago, Quintessence; 1999. p.
13-6.

51. Rosa FP, Lia RC, de Souza KO, Goissis G,
Marcantonio E Jr. Tissue response to polyanionic
collagen: elastin matrices implanted in rat calvaria.
Biomaterials. 2003;24(2):207-12.

61. Tripathi P, Tripathi P, Kashyap L, Singh V. The role
of nitric oxide in inammatory reactions. FEMS
Imunol Med Microbiol. 2007;51:443-52.

52. Rosenberg E, Rose LF. Biologic and clinical
considerations for autografts and allografts in
periodontal regeneration therapy. Dent Clin North
Am. 1998;42(3):467-90.
53. Sader MS, Balduino A, Soares Gde A, Borojevic R.
Effect of three distinct treatments of titanium
surface on osteoblast attachment, proliferation, and
differentiation. Clin Oral Implants Res.
2005;16:667-75.
54. Service RF. Tissue engineers build new bone.
Science. 2000;289(5484):1498-500.
55. Shukla R, Bansal V, Chaudhary M, Basu A, Bhonde
RR, Sastry M. Biocompatibility of gold
nanoparticles and their endocytotic fate inside the
cellular compartment: a microscopic overview.
Langmutr. 2005;21:10644-54.
56. Sicca CM, Corotti MV, Sgarbosa SH, Cestari TM,
Cavalcanti MG, Ferreira PM, et al. Comparative
histomorphometric and tomographic analysis of
maxillary sinus oor augmentation in rabbits using
autografts and xenografts. J Biomed Mater Res B
Appl Biomater. 2008;86(1):188-96.
57. Silva MJ, Brodt MD. Mechanical stimulation of
bone formation is normal in the SAMP6 mouse.
Calcif Tissue Int. 2008;82:489-97.
58. S i v a k u m a r M , R a o K P. P r e p a r a t i o n ,
characterization and in vitro release of gentamicin
from corallie hydroxiapatite-gelatin composite
microspheres. Biomaterials. 2002;23:3175-81.
59. Song E, Yeon Kim S, Chun T, Byun HJ, Lee YM.
Collagen scaffolds derived from a marine source
and their biocompatibility. Biomaterials.
2006;27(15):2951-61.

62. Ueda M, Tohnai I, Nakai H. Tissue engineering
research in oral implant surgery. Artif Organs.
2001;25(3):164-71.
63. Vanderrest M, Garrone R. Collagen family of
proteins. FASEB J. 1991;5:2814-23.
64. Vats A, Tolley NS, Polak JM, Gough JE. Scaffolds
and biomaterials for tissue engineering: a review of
clinical applications. Clin Otolaryngol Allied Sci.
2003;28(3):165-72.
65. Vervoordeldonk MJ, TAK PP. Cytokines in
rheumatoid arthritis. Curr Rheumatol Rep.
2002;4:208-17.
66. Wiedmann-Al-Ahmad M, Gutwald R, Gellrich
NC, Hübner U, Schmelzeisen R. Search for ideal
biomaterials to cultivate human osteoblast-like
cells for reconstructive surgery. J Mater Sci Mater
Med. 2005;16(1):55-66.
67. Wu YC, Shaw SY, Lin HR, Lee TM, Yang CY.
Bone tissue engineering evaluation based on rat
calvaria stromal cells cultured on modied PLGA
scaffolds. Biomaterials. 2006;27:896-904.
68. Yano K, Nakagawa N, Yasuda H, Tsuda E,
Higashio K. Synovial cells from a patient with
rheumatoid arthritis produce osteoclastogenesis
inhibitory factor/osteoprotegerin: reciprocal
regulation of the production by inammatory
cytokines and basic broblast growth factor. J
Bone Miner Metab. 2001;19:365-72.
69. Yefang Z, Hutmacher DW, Varawan SL, Meng LT.
Comparision of human alveolar osteoblasts
cultured on polymer-ceramic composite scaffolds
and tissue culture plates. Int J Oral Maxillofac
Surg. 2007;36(2):137-45.
70. Yoshikawa T. Bone reconstruction by cultured
bone graft. Mat Sci Engineer C. 2000;13:29­37.

68

Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:59-69.

ARTIGO DE REVISÃO

Takamori ER, Deveza APQ, Silva SRLR, Zambuzzi WF, Granjeiro JM

71. Zambuzzi WF, Granjeiro JM, Parikh K, Yuvaraj S,
Peppelenbosch MP, Ferreira CV. Modulation of
Src activity by low molecular weight protein
tyrosine phosphatase during osteoblast
differentiation. Cell Physiol Biochem. 2008;22(56):497-506.
72. Zambuzzi WF, Oliveira RC, Alanis D, Menezes R,
Letra A, Cestari T, et al. Microscopic analisys of
porous microgranular bovine anorganic bone
implanted in rat subcutaneous tissue. J Appl Oral
Sci. 2005;13(4):382-6.
73. Zambuzzi WF, Oliveira RC, Pereira FL, Cestari
TM, Taga R, Granjeiro JM. Rat subcutaneous
tissue response to macrogranular porous anorganic
bovine bone graft. Braz Dent J. 2006;17(4):274-8.
74. Zambuzzi WF, Oliveira RC, Piozzi R, Cestari TM,
Taga R, Buzalaf MAR, et al. Avaliação histológica
do implante do osso fetal bovino acelular e
desmineralizado em subcutâneo de ratos. Rev Bras
Ortop. 2006;41(6):227-32.
75. Z a m b u z z i W F, Ya n o C L , C a v a g i s A D ,
Peppelenbosch MP, Granjeiro JM, Ferreira CV.
Ascorbate-induced osteoblast differentiation
recruits distinct MMP-inhibitors: RECK and TIMP2. Mol Cell Biochem. 2009;322(1-2):143-50.
76. Zárate-Kalfópulos B, Reyes-Sánchez A. Bone
g r a f t s i n o r t h o p e d i c s u rg e r y. C i r C i r.
2006;74(3):217-22.
77. Zhao X, Jain S, Benjamin Larman H, Gonzalez S,
Irvine DJ. Directed cell migratio n v i a
chemoattractants released from degradable
microspheres. Biomaterials. 2005;26:5048-63.

Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:59-69.

69