Mónica Sofia Moreira da Silva Moreno

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Universidade Fernando Pessoa
Faculdade de Ciências da Saúde

Porto, 2014

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

II

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Mónica Sofia Moreira da Silva Moreno

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Universidade Fernando Pessoa
Faculdade de Ciências da Saúde

Porto, 2014

III

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

__________________________________________
(Mónica Sofia Moreira da Silva Moreno)

Dissertação apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

IV

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Resumo
Actualmente milhões de pessoas em todo o mundo são afectadas por problemas
degenerativos e inflamatórios dos ossos e articulações. Estes representam cerca de
metade das doenças crónicas desenvolvidas em indivíduos com mais de 50 anos,
conduzindo a problemas de dor prolongada e incapacidade física. A sua prevalência
aumenta com a idade e estilo de vida, pelo que, com o aumento da população idosa,
estes casos têm vindo a aumentar. A resolução destas situações normalmente exige
cirurgias que envolvem a aplicação de, implantes ou enxertos ósseos. Apesar do êxito
destas soluções terapêuticas, têm surgido alguns inconvenientes, relacionados com o
facto de os implantes serem susceptíveis ao desenvolvimento de infecções e dos
enxertos, poderem originar dores, infecções, morte dos tecidos do local dador e
rejeições imunológicas.
Com a finalidade de colmatar estas limitações surgiu a Engenharia de Tecidos, que
constitui uma área promissora na reparação e reconstrução de lesões ósseas, através do
desenvolvimento de matrizes tridimensionais porosas, habitualmente designadas por
scaffolds. Associadas a estas estruturas estão células osteoprogenitoras e factores de
crescimento, que conduzem à formação de tecido ósseo novo, através da estimulação da
capacidade natural de regeneração dos tecidos do paciente.
Neste trabalho de revisão bibliográfica é feita a compilação das metodologias e
conceitos relacionados com a técnica da Engenharia de Tecidos na substituição de
tecidos ósseos. A composição do tecido ósseo e os biomateriais utilizados em implantes
ortopédicos são referidos. Os diferentes tipos de scaffolds e os seus diversos métodos de
produção são descritos. Por fim, são abordadas várias técnicas (in vitro e in vivo) para a
avaliação dos biomateriais de uso humano.

Palavras-chave: Tecido Ósseo; Enxertos; Implantes; Biomateriais; Engenharia de
Tecidos; Scaffolds.

V

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Abstract
Currently million people worldwide are affected by inflammatory and degenerative
problems of the bones and articulations. These conditions represent about a half of the
chronic diseases developed in individuals over 50 years, leading to problems of
prolonged pain and physical inability. Their prevalence rises with age and lifestyle.
Therefore, with the growth of the elderly population that has been observed, these cases
have been increasing. These situations usually require surgery, where bone grafts or
implants are used. Nonetheless, despite the success of these therapeutic solutions, some
drawbacks have been pointed out, which are related the risk of development of
infections for implants. In contrast, for grafts, pains, infections, tissue death on the
donor site and immunological rejections have been described.
To overcome these limitations the tissue engineering have been developed, which
constitutes a promising area for repair and rebuild bone lesions, through the
development of three-dimensional porous matrices, commonly known as scaffolds.
Associated with these structures are the osteoprogenitor cells and growth factors, that
lead to the formation of new bone by stimulating the natural regeneration ability of the
patient's tissue.
In this review work is presented a compilation of the most important methodologies and
concepts that are related to the technique of tissue engineering for the replacement of
bone tissues. The composition of the bone tissue and the biomaterials more used in
orthopedic implants are referred. Moreover, the different types of scaffolds and their
different production methods are described. Finally, various in vitro and in vivo
techniques for the evaluation of biomaterials for human use are discussed.

Key-words: Bone Tissue; Grafts; Implants; Biomaterials; Tissue Engineering;
Scaffolds.

VI

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Agradecimentos

Este espaço é dedicado à expressão do meu agradecimento a um conjunto de pessoas
que tornaram possível a realização desta dissertação e conclusão do Mestrado Integrado
em Ciências Farmacêuticas.
Em primeiro lugar agradeço à Professora Doutora Ana Catarina Silva pela
disponibilidade, dedicação e empenho fundamentais na organização e desenvolvimento
deste trabalho.
Quero também agradecer, como não podia deixar de ser, à minha família, em especial
aos meus pais, irmã e tia Margarida pela dedicação e acompanhamento ao longo do meu
percurso académico.
E para terminar, também o meu agradecimento a todos os amigos que fiz ao longo do
curso, com os quais vivenciei esta experiência e que juntos me ajudaram a ultrapassar
esta etapa.

VII

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Índice Geral

Resumo..............................................................................................V
Abstract.............................................................................................VI
Agradecimentos..................................................................................VII
Índice Geral......................................................................................VIII
Índice de tabelas...................................................................................IX
Índice de figuras...................................................................................X
Lista de abreviaturas...........................................................................XIII
1. Medicina Regenerativa versus Engenharia de Tecidos.....................................1
2. Tecido ósseo......................................................................................4
2.1. Composição e estrutura.......................................................................4
2.2. Formação e regeneração......................................................................7
2.3. Problemas degenerativos e inflamatórios dos ossos e articulações.....................8
3. Biomateriais.....................................................................................10
3.1.Implantes ortopédicos versus Enxertos ósseos............................................11
3.2. Biomateriais sintéticos.......................................................................14
3.2.1. Metálicos....................................................................................16
3.2.2. Cerâmicos...................................................................................17
3.2.3. Poliméricos.................................................................................18
3.2.4.Compósitos..................................................................................22
3.3. Scaffolds........................................................................................23
3.3.1. Tipos de scaffolds .........................................................................24
3.3.2. Técnicas de produção de scaffolds......................................................25
3.3.2.1.Técnicas tradicionais para a produção de scaffolds porosos........................26
3.3.2.2.Técnicas modernas para a produção de scaffolds porosos..........................30
3.3.2.3. Técnicas de produção de scaffolds à base de hidrogeles...........................36
3.3.2.4. Técnicas de produção de scaffolds fibrosos..........................................39
3.3.2.5. Técnicas de produção de scaffolds à base de microesferas........................43
3.3.2. Células, factores de crescimento e vascularização....................................44
3.4. Avaliação dos scaffolds.....................................................................46
4. Conclusões.......................................................................................48
5. Referências bibliográficas.....................................................................49
VIII

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Índice de tabelas

Tabela 1: Exemplos de polímeros naturais e sintéticos aplicados em Engenharia de
Tecidos .............................................................................................20
Tabela 2: Vantagens e desvantagens dos diferentes tipos de scaffolds.....................25

IX

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Índice de figuras

Figura 1: Ferramentas essenciais da engenharia de tecidos: cultivo de células
em scaffold associado a factores de crescimento, na presença de nutrientes...................2
Figura 2: Composição orgânica e inorgânica (mineral) do tecido ósseo.....................5

Figura 3: Diferenciação das células progenitoras dos osteoblastos com a intervenção e
dos factores de crescimento........................................................................5
Figura 4: Estrutura do tecido ósseo...............................................................6
Figura 5: Prótese de substituição da anca......................................................12
Figura 6: Utensílios de imobilização de fracturas ­ placa e parafusos de titânio.........12

Figura 7: Evolução cronológica do desenvolvimento dos biomateriais utilizados
na reparação e regeneração óssea...............................................................15

Figura 8: Scaffold metálico.......................................................................17
Figura 9: Scaffolds de fosfato de cálcio.........................................................18
Figura 10: Scaffolds de colagénio...............................................................21

Figura 11: Scaffold poroso constituído por um material compósito (hidroxiapatite/ácido
poli (láctico-co-glicólico))........................................................................22

Figura 12: Exemplos das diferentes formas de scaffolds poliméricos em Engenharia de
Tecidos ...............................................................................................24

Figura 13: Técnica da formação de espumas gasosas........................................26

Figura 14: Scaffold obtido por formação de espumas gasosas..............................27
X

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 15: Esquema representativo da técnica de liofilização..............................27

Figura 16: Scaffolds preparados por liofilização..............................................28

Figura 17: Representação da técnica evaporação de solvente/lixiviação de partículas...28

Figura 18: Scaffolds obtidos pelo método de lixiviação de partículas.....................29

Figura 19: Método da separação de fase.......................................................29
Figura 20: Scaffolds preparados por separação de fase.......................................30
Figura 21: Sistema usado na impressão a três dimensões ...................................31
Figura 22: Scaffolds produzidos pela técnica de impressão a três dimensões.............32

Figura 23: Funcionamento da técnica da modelagem por fusão e deposição.............33
Figura 24: Scaffold sintetizado pela técnica da modelagem por fusão e deposição......33

Figura 25: Mecanismo da técnica de sinterização a laser....................................34
Figura 26: Scaffolds produzidos pelo método de sinterização a laser......................34
Figura 27: Processos envolvidos na produção de estruturas por estereolitografia........35

Figura 28: Funcionamento de hidrogeles injectáveis como scaffolds......................36

Figura 29: Técnicas usadas na produção de microgeles...............................................38

Figura 30: Exemplos de microgeles com diferentes formas.................................39
Figura 31: Técnica de auto-montagem utilizando péptidos anfifílicos.....................40
XI

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 32: Scaffold fibroso preparado pela técnica de auto-montagem....................40
Figura 33: Esquema representativo da técnica de separação de fase........................41

Figura 34: Rede de nanofibras obtida pela técnica de separação de fase..................41

Figura 35: Funcionamento da técnica de electrofiação.......................................42

Figura 36: Scaffold fibroso obtido por electrofiação..........................................42

Figura 37: Distribuição de células tronco a partir de microesferas nanofibrosas.........43
Figura 38: Biorreactores utilizados em Engenharia de Tecidos ósseos.....................44

XII

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Lista de abreviaturas
CAD ­ Desenho assistido por computador
CAM ­ Manufactura assistida por computador
DNA ­ Ácido desoxirribonucleico
3 ­ DP ­ Impressão a três dimensões
EGC ­ Células germinativas embrionárias
ESC ­ Células tronco embrionárias
FDM ­ Modelagem por fusão e deposição
LSL ­ Litografia de varrimento a laser
MSCs ­ Células tronco mesênquimais
PCL ­ Poli-caprolactona
PGA ­ Poli (ácido glicólico)
PLA ­ Poli (ácido láctico)
PMMA ­ Polimetilmetacrilato
PPF ­ Poli (propileno fumaratos)
RNA ­ Ácido ribonucleico
SLS ­ Sinterização selectiva a laser
SLSS ­ Sinterização selectiva a laser de superfície
UHMWPE ­ Polietileno de ultra elevado peso molecular

XIII

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

XIV

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

1. Medicina Regenerativa versus Engenharia de Tecidos
Nas últimas décadas do século XX a Biotecnologia sofreu uma colossal evolução, tanto
ao nível da obtenção de novos conhecimentos, como também no aumento do número de
processos biotecnológicos e do seu emprego na criação de materiais e dispositivos
aplicados nas áreas da saúde e da prestação de serviços (Oliveira et al. 2010). Neste
contexto surge a Medicina Regenerativa, na qual se insere a Engenharia de Tecidos.
A privação de um órgão ou de uma parte do corpo devido a anomalias congénitas,
doenças graves (por ex. cancro) ou traumas origina, para além do desaparecimento da
sua função fisiológica normal, perturbações psicológicas com repercussões sociais
(Rodrigues, 2013).
Nestas situações, a terapia farmacológica convencional não é eficaz, sendo a solução de
primeira escolha o recurso à engenharia biomédica, para efectuar transplantes de órgãos
e tecidos artificiais, com o intuito de restabelecer os originais. Contudo, apesar dos
progressos que têm sido efectuados, no sentido do melhoramento das características de
biocompatibilidade e biofuncionalidade dos órgãos e tecidos artificiais, estes ainda não
são considerados totalmente satisfatórios. Em alternativa, pode recorrer-se à
transplantação de órgãos e tecidos a partir de dadores, embora estes existam em número
escasso. Além disso, estes processos estão sempre associados a rejeições imunológicas,
que implicam a necessidade de efectuar uma terapia imunossupressora concomitante
(Ikada, 2006).
Com o objectivo de colmatar as falhas identificadas pelo uso das técnicas de engenharia
biomédica e da falta de dadores, na sequência de uma reunião do comité da Fundação
Nacional da Ciência dos Estados Unidos da América (EUA), surgiu um novo ramo da
biotecnologia médica, a Engenharia de Tecidos. Esta técnica baseia-se em tirar partido
da capacidade natural de regeneração dos tecidos e órgãos do próprio paciente,
ultrapassando as limitações referidas acima (Ikada, 2006). Para o efeito são utilizadas
como ferramentas essenciais as células, os scaffolds ou estruturas tridimensionais (3D) e
os factores de crescimento (Figura 1).

1

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 1: Ferramentas essenciais da engenharia de tecidos: cultivo de células em
scaffold associado a factores de crescimento, na presença de nutrientes (Adaptado de
Sharma et al. 2014).
São as células que sintetizam a matriz do novo tecido, podendo ser classificadas de
acordo com a sua origem, em autólogas (células do próprio paciente), alogénicas
(células humanas de outro paciente) e xenogénicas (células de origem animal).
Adicionalmente, as células podem também ser classificadas com base na disparidade do
seu grau de diferenciação. Os scaffolds ou estruturas 3D são formados por matrizes
porosas, que fornecem um suporte físico e ambiente apropriado para as células
proliferarem e adquirirem uma conformação semelhante à que têm nos órgãos e tecidos
do organismo. Os factores de crescimento compreendem uma diversidade de proteínas
importantes na proliferação e diferenciação das células, auxiliando e impulsionando
estas a regenerar o novo tecido (Ikada, 2006).
Com efeito, a Engenharia de Tecidos engloba a aplicação de conhecimentos das áreas
da engenharia e das ciências da vida, como auxiliares da regeneração e restauração dos
tecidos deformados ou lesados, gerando substitutos biológicos capazes de reparar,
conservar ou aperfeiçoar o desempenho e actividade dos mesmos, aprimorando e
desenvolvendo novas terapêuticas e fabricando novos biomateriais (Tabata, 2009).

2

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Aproximadamente uma década depois do surgimento das técnicas de Engenharia de
Tecidos, nasce a Medicina Regenerativa. Esta ciência surge após a comunicação do
êxito do desenvolvimento das células estaminais embrionárias (Embryonic Stem Cells) e
as células germinativas embrionárias (Embryonic Germ Cells) humanas, por dois grupos
de investigação dos EUA (Thomson et al. 1998; Shamblott et al. 1998). As células
estaminais possuem elevado potencial terapêutico, uma vez que possuem elevada taxa
de crescimento e a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células presentes
no organismo. Estas células são obtidas a partir de embriões recentemente formados
(blastocistos), o que faz com que surjam limitações à sua aplicação, relacionadas com o
surgimento de questões éticas, que emergem devido à necessidade de destruição dos
embriões (Ikada, 2006).
A Medicina Regenerativa constitui uma área mais abrangente que a Engenharia de
Tecidos, tendo como objectivo a substituição, reparação ou restauração das funções
naturais de órgãos ou tecidos danificados, utilizando como terapêutica o recurso a
células vivas (células estaminais embrionárias ou adultas), administradas isoladamente
ou em associação com materiais biocompatíveis. Trata-se pois de um campo
multidisciplinar que associa as áreas da terapia celular e da Engenharia de Tecidos
(Langer e Vacanti, 1993; Polak, 2010).

3

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

2. Tecido ósseo
Com o objectivo de regenerar, reparar e impulsionar diferentes tecidos funcionais,
através do fabrico de scaffolds ósseos, que devem ser representações convenientes do
osso, a engenharia de tecidos ósseos (bone tissue engineering) tem de entender
primeiramente a sua biologia e fisiologia, o que engloba a compreensão da sua
estrutura, mecânica e formação (Polo-Corrales et al. 2014).
O osso humano é um tecido dinâmico e bastante vascularizado que cresce, renova-se e
mantém-se activo durante toda a vida do organismo, sendo responsável por várias
funcionalidades e capaz de responder a uma multiplicidade de estímulos (por ex.
metabólicos, físicos e endócrinos) (Amini et al. 2012).
A dinâmica e constante reorganização do tecido ósseo é devida ao facto deste se
encontrar num permanente ciclo de reabsorção e renovação. Neste ocorre uma sucessiva
permuta química e remodelação estrutural devido ao seu reservatório de iões minerais,
particularmente de cálcio e fósforo e células ósseas, que assumem várias formas e
funções, conduzindo à constante formação, reabsorção, reparação e conservação da sua
micro-arquitectura (Amini et al. 2012). Este procedimento garante a sustentação do
esqueleto, pois elimina osso antigo substituindo-o por matriz nova (Tan et al. 2014).
Entre as actividades do tecido ósseo destacam-se (Stevens, 2008): a locomoção
resultante da contracção muscular; a garantia da resistência de carga adequada; a
sustentação do organismo na posição ortostática; a protecção dos órgãos internos;
manutenção da homeostasia, através do armazenamento dos iões cálcio e fósforo,
ajustando assim a concentração de electrólitos essenciais no sangue e a retenção dos
elementos biológicos indispensáveis na hematopoiese. Com efeito, modificações na
estrutura óssea, por lesão ou doença, podem interferir no equilíbrio corporal e
consequentemente afectar a qualidade de vida dos indivíduos (Salgado et al. 2004).

2.1.Composição e estrutura
O tecido ósseo é composto por duas partes distintas da matriz extracelular óssea uma
orgânica não mineralizada formada essencialmente por fibras de colagénio tipo I, e uma

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Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

fase inorgânica mineralizada organizada principalmente por cristais de fosfato de cálcio,
sob a forma de hidroxiapatite (Figura 2) (Amini et al. 2012).

Figura 2: Composição orgânica e inorgânica (mineral) do tecido ósseo (Adaptado de
Alvarez e Nakajima, 2009).
A matriz extracelular óssea é gerada através da diferenciação dos osteoblastos (Figura
3), resultante da estimulação desencadeada pela acção dos factores de crescimento
existentes no organismo (por ex. o factor de crescimento de fibroblastos) sobre as suas
células progenitoras, os pré-osteoblastos provenientes de células tronco mesênquimais
(mesenchymal stem cells) (Polo-Corrales et al. 2014).

Factores de crescimento

Figura 3: Diferenciação das células progenitoras dos osteoblastos com a intervenção
dos factores de crescimento (Adaptado de Luu et al. 2009 ).

O processo de formação da matriz extracelular óssea ocorre em três etapas essenciais
(Polo-Corrales et al. 2014): i) proliferação das células, ii) maturação da matriz, iii)

5

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

mineralização da matriz. Na primeira fase ocorre secreção de proteínas pelos
osteoblastos, originando a componente não mineralizada da matriz extracelular óssea.
No estádio seguinte sucede-se a reticulação das suas proteínas, promovendo uma
estrutura mais compacta e estável. Por último ocorre a ligação das fibras de colagénio
tipo I e a deposição dos minerais inorgânicos, originando a outra componente da matriz
extracelular óssea.
O tecido ósseo, além de ser composto pela matriz extracelular óssea, também contém na
sua composição tecido vivo (células), os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos. A
função dos primeiros está relacionada com a formação do osso novo, os osteócitos são
as células mais abundantes do osso, tratando-se de células de revestimento e os
osteoclastos intervêm na reabsorção do tecido ósseo antigo (Bose et al. 2013).

Figura 4: Estrutura do tecido ósseo (Adaptado de Buck e Dumanian, 2012).

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Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Quanto à estrutura do tecido ósseo (Figura 4), são encontradas duas formas distintas, o
osso esponjoso ou trabecular e o osso cortical ou compacto. O primeiro consiste na
porção interior do osso de natureza porosa. Por outro lado, o cortical é bastante denso,
correspondendo à sua camada exterior e possuindo menor porosidade (Bose et al.
2013).
O osso esponjoso é constituído por uma rede de trabéculas interligadas, que possuem no
seu interior medula e proporcionam uma elevada área de superfície, que possibilita a
difusão dos nutrientes e dos factores de crescimento, tornando-o metabolicamente mais
activo que o osso cortical. Por este motivo, o osso esponjoso sofre renovação com mais
frequência. Por outro lado, o osso cortical está organizado em vários ósteons, que se
encontram condensados (unidade estrutural), formam lamelas concêntricas de matriz
óssea concêntrica em torno de um canal central designado por canal de Havers. Com
efeito, enquanto que as lamelas irregulares, designadas por trabéculas do osso esponjoso
tornam possível a alteração da forma e assimilação do peso, o osso cortical é
responsável pela atribuição de torção, compressão e resistência à flexão (Polo-Corrales
et al. 2014).

2.2. Formação e regeneração
Como referido anteriormente, o osso humano é conhecido pelas suas capacidades de
crescimento, regeneração e remodelação. O seu processo de formação é efectuado por
dois tipos de mecanismos, o intramembranoso e o endocondral. Ambos os métodos
envolvem a actividade de células mesênquimais, sendo que no primeiro, estas
diferenciam-se directamente em osteoblastos, enquanto no outro, se diferenciam em
condrócitos, que depois de sofrer mineralização é substituído por osso (Amini et al.
2012).
A regeneração óssea constitui um processo fisiológico complexo que abrange diversos
tipos de células e sinais moleculares, intra e extracelulares (Romagnoli et al. 2013). Este
procedimento caracteriza-se por uma sequência de actividades celulares que se iniciam
sempre com a formação de um hematoma e de uma resposta inflamatória, envolvendo
aspectos característicos dos dois mecanismos de ossificação já mencionados. Com o
estabelecimento da resposta inflamatória ocorre a libertação de citoquinas e factores de
7

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

crescimento ósseo, conduzindo primeiramente à criação de osso intramembranoso, que
resulta num tecido mole que estabiliza a lesão desenvolvida. De seguida, este sofre
condrogénese que, origina tecido ósseo endocondral, tipicamente na forma trabecular,
ocorrendo a posterior mineralização (Amini et al. 2012). A conclusão do processo
ocorre quando parte deste osso trabecular formado se torna compacto e o seu excesso é
reabsorvido pelos osteoclastos, desencadeando assim a remodelação do tecido ósseo
(Guzmán et al. 2014).

2.3. Problemas degenerativos e inflamatórios dos ossos e articulações
Os problemas degenerativos e inflamatórios dos ossos e articulações afectam milhões de
pessoas em todo o mundo, sendo responsáveis por cerca de metade das doenças crónicas
em indivíduos com mais de 50 anos (Navarro et al. 2008). Entre estas destacam-se a
Osteoartrite, Artrite reumatóide e Osteoporose, pois são as que mais comummente
afectam a população mundial (Woolf e Pfleger, 2003).
A Osteoartrite é a doença degenerativa das articulações mais usual, que se caracteriza
pela ocorrência de regiões de deterioração ou perda de cartilagem articular, sendo a
osteoartrite do joelho a mais frequente (Musumeci et al. 2014).
As doenças inflamatórias crónicas em que se enquadram a artrite reumatóide e a
osteoporose estão relacionadas com uma sucessiva perda de osso, devido a alterações no
processo de remodelação óssea, nas quais ocorre aumento da reabsorção do osso e
diminuição da sua formação (Hardy e Cooper, 2009). A artrite reumatóide é descrita
pelo desgaste nas articulações e por privação de osso periarticular, aumentando
significativamente a possibilidade de desenvolver osteoporose (Baarsen et al. 2009;
Ringe e Sittinger, 2009). Esta última é caracterizada pela redução da densidade óssea,
que consequentemente conduz a um maior enfraquecimento do osso e risco de ruptura.
Devido ao acréscimo da população idosa é um dos mais frequentes e sérios problemas
de saúde pública (Tan et al. 2014; Luu et al. 2009).
Como referido, a prevalência de desordens inflamatórias crónicas aumenta com o
decorrer da idade. Por outro lado, o desenvolvimento de grande parte destas é afectado
pelo estilo de vida dos indivíduos, como a obesidade e a falta de actividade física
8

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

(Woolf e Pfleger, 2003). Os problemas de saúde que advêm destas patologias na maior
parte dos casos necessitam do recurso a cirurgias, para implantar dispositivos
permanentes ou temporários, para a substituição de articulações ou solucionar fracturas
ósseas (Navarro et al. 2008).

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Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3. Biomateriais
Os seres humanos utilizam biomateriais desde a antiguidade, em que eram usados
materiais naturais na tentativa de mudar a disposição dos tecidos lesados por alguma
enfermidade. Ao longo dos tempos estes materiais foram sofrendo alterações, no sentido
de melhorar e facilitar a sua acção, até que no século XX surgiram e começaram a ser
empregues os polímeros sintéticos, os cerâmicos e as amálgamas de metais (Huebsch e
Mooney, 2009).
Neste sentido, a definição de biomaterial surgiu em 1986, numa conferência sobre
biomateriais: " um material não vivo usado em implantes ou dispositivos médicos,
planeado para interagir com sistemas biológicos" (Williams, 1987). Esta descrição
trouxe alguma controvérsia por se restringir a materiais não vivos, pelo que em 1991,
em outra conferência, este conceito foi redefinido como "todo o material destinado a
contactar com sistemas biológicos para avaliar, tratar, reforçar ou substituir qualquer
tecido, órgão ou função do organismo" (William et al.1992).
Sendo assim, um biomaterial destinado a contactar com os tecidos deve obedecer a
vários critérios, com o intuito de manter as suas características intrínsecas, tais como
(Oliveira et al. 2010; Ratner, 2004; Tabata, 2009): biocompatibilidade para não
desencadear reacções adversas no meio fisiológico; esterilidade para evitar o surgimento
de infecções; osteocondutividade para promover a adesão celular e o crescimento ósseo;
biodegradabilidade para uma fácil integração no organismo; propriedades mecânicas
apropriadas à funcionalidade para que foram desenvolvidos; ausência de toxicidade;
facilidade de manipulação; possibilidade de processamento em larga escala e densidade
semelhante à dos meios biológicos.
A noção de substituição do osso envolve a troca da estrutura óssea através da sua
reconstituição ou do preenchimento de uma perda de substância óssea. Esta mudança
estrutural pretende possibilitar a migração, proliferação e diferenciação das células
ósseas e impulsionar a vascularização, usufruindo da resposta natural do organismo face
à lesão ou perda de tecido (Romagnoli e Brandi, 2014).
Na prática clínica são utilizadas técnicas de reconstrução cirúrgica e substituição,
recorrendo a dispositivos mecânicos e à transplantação de vários tipos de tecidos. No
caso da cirurgia de reconstrução, os dispositivos biomédicos usados podem não garantir
10

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

a total substituição das funcionalidades biológicas do órgão ou tecido em questão e,
consequentemente, não conseguem prevenir a sua progressiva deterioração (Tabata,
2009). Deste modo a transplantação de órgãos e tecidos foi aumentando
progressivamente, como sendo uma solução terapêutica eficaz. No entanto, as técnicas
de transplantação apresentam algumas limitações, que se relacionam sobretudo com a
ocorrência de rejeições e o risco de contrair doenças. As técnicas de Engenharia de
Tecidos ósseos vieram ultrapassar estas restrições, constituindo uma alternativa
promissora na substituição óssea, em casos de irregularidades ortopédicas, neoplasias
ósseas, tratamento de artroses, estabilização de segmentos espinais e cirurgia ortopédica
e reconstrutiva (Dimitriou et al. 2011). Os desenvolvimentos na área da Engenharia de
Tecidos ósseos conduziram ao aparecimento de novos dispositivos funcionais, que
envolvem a interacção das células ósseas em matrizes porosas de materiais sintéticos ou
naturais, com a finalidade de tentar reproduzir o microambiente do osso e facilitar a sua
regeneração (Polo-Corrales et al. 2014).

3.1. Implantes ortopédicos versus Enxertos ósseos
Os implantes e as próteses ortopédicos compõem um vasto ramo pertencente à indústria
biomédica ao nível mundial. Tratam-se de dispositivos desenvolvidos para exercerem
funções específicas após implantação no organismo, com o intuito de manter a
estabilidade física e química e fornecer solidez mecânica, com o mínimo de toxicidade
para o tecido receptor (Wang et al. 2011).
Normalmente os implantes e próteses são utilizados para a imobilização de fracturas de
ossos longos, rectificação e estabilização de fracturas espinais e malformações,
substituição de articulações e aplicações maxilofaciais, tornando mais fácil a
recuperação das funcionalidades comprometidas e o alívio da dor. Um implante
ortopédico geralmente é utilizado para adicionar volume ou alguma função a uma parte
do organismo já existente, sendo de cariz definitivo enquanto uma prótese não é
definitiva, sendo necessário o acompanhamento do doente, para a verificação da sua
integração no organismo. Normalmente é usada para substituir um membro ou uma
parte do organismo(Goodman et al. 2013).
Os dispositivos mais usados são próteses de substituição de articulações, como a da
anca (Figura 5) e do joelho; instrumentos de fusão espinal e utensílios de imobilização
11

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

de fracturas, como os parafusos (Figura 6), as chapas e as varetas intramedulares (Wang
et al. 2011).

Figura 5: Prótese de substituição

Figura 6: Utensílios de imobilização

da anca (Huebsch e Mooney, 2009).

de fracturas ­ placa e parafusos de
titânio (Quiao et al. 2014).

Apesar das próteses e dos implantes serem mecânica e biologicamente adequados, estes
podem desencadear infecções. Devido à colonização bacteriana e à geração de biofilmes
(i.e. à adesão de microrganismos à sua superfície) sobre os dispositivos (Dunne et al.
2002;Goodman et al. 2013). Estas condições originam infecções agudas ou crónicas no
osso subjacente, que podem alastrar aos tecidos moles circundantes, dificultando a
recuperação do paciente (Goodman et al. 2013).
O problema da formação dos biofilmes sobre os implantes prende-se com o facto de
estes protegerem os microrganismos da acção do sistema imunitário dos pacientes.
Deste modo, estes são sujeitos a uma terapia com antibióticos, podendo o seu uso
prolongado conduzir ao desenvolvimento resistências bacterianas e toxicidade local
(Hetrick e Schoenfisch, 2006; van de Belt et al. 2001).
O surgimento das infecções ortopédicas associadas aos implantes implica a necessidade
de efectuar uma cirurgia adicional para a remoção do dispositivo. Este facto tem levado
ao desenvolvimento de técnicas para a sua prevenção e terapêutica, que passam pela
utilização de um tipo de biomaterial mais adequado para formar o implante ou pela
12

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

produção de coberturas para protecção do dispositivo, resistentes às infecções e que não
interfiram com a capacidade imunológica local do paciente e integração no tecido
(Goodman et al. 2013).
Não obstante as suas vantagens na terapia, a actual estratégia terapêutica em vigor são
os enxertos ósseos, em particular os autólogos, uma vez que estes possuem e conciliam
os elementos e condições fundamentais para estimular o crescimento e regeneração de
osso (Romagnoli e Brandi, 2014).
O poder de regeneração por parte destes enxertos é avaliado a partir de três mecanismos
complementares, designados por osteoindução, osteocondução e osteogénese (Amini et
al. 2012). O primeiro trata-se de uma característica inerente imprescindível à
regeneração do tecido ósseo, pois estimula os factores de crescimento exógenos a
promover a diferenciação das células que iniciam o seu processo de formação. A
osteocondução fornece uma matriz de suporte e facilita a adesão das células ósseas e a
osteogénese é o processo que induz a geração efectiva de tecido por parte das células
ósseas (Polo-Corrales et al. 2014).
Os enxertos ósseos são usados para dilatar ou estimular a criação de osso novo no
tratamento de fracturas esqueléticas, na substituição e regeneração em situações de
perda de tecido ósseo. Entre estes destacam-se os enxertos autólogos e os enxertos
alogénicos. Nos primeiros é transplantado tecido ósseo do próprio paciente (osso
esponjoso, cortical ou vascularizado) normalmente da crista ilíaca para o local da lesão.
Este tipo de transplantes apresenta inconvenientes como dor, infecções, cicatrização e
hemorragia, pois a extracção de tecido é traumática, causando a morte dos tecidos do
local dador. Por outro lado, os enxertos alogénicos envolvem a transferência de tecido
entre dois indivíduos da mesma espécie (cadáveres ou doadores vivos). A sua vantagem
em relação aos anteriores é a maior disponibilidade, o que evita a necessidade de uma
nova cirurgia para a extracção de osso. No entanto, estes não possuem a capacidade
osteogénica dos anteriores, uma vez que não contêm elementos celulares, devido aos
processos de tratamento a que são sujeitos, têm reduzida capacidade osteoindutiva,
podem conduzir a infecções e, sobretudo, a rejeições imunológicas (Roberts e
Rosenbaum, 2012).

13

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Desta forma, as limitações da utilização têm estimulado a investigação no sentido da
procura de alternativas, tanto no que diz respeito à utilização de novos biomateriais
biologicamente funcionais como de terapias clínicas promissoras (Dimitriou et al.
2011).

3.2. Biomateriais sintéticos
O crescimento e progresso das investigações acerca dos biomateriais deu-se de acordo
com os avanços nos conhecimentos adquiridos acerca do microambiente do local das
lesões. Consequentemente, as alterações nos requisitos e características pretendidas para
um determinado material, conduziram à criação de três gerações de biomateriais (Figura
7). A primeira geração é composta por materiais bioinertes, a segunda engloba materiais
bioactivos e biodegradáveis e a terceira, projectada para impulsionar respostas celulares
específicas ao nível molecular, por conciliar a bioactividade e biodegradabilidade da
geração anterior (Hench e Polak, 2002).
A primeira geração de biomateriais surgiu entre os anos 60 e 70, com a finalidade de
serem utilizados em implantes médicos (Hench, 1980). Com o aparecimento destes
materiais aspirava-se obter propriedades (físicas e mecânicas) semelhantes às do tecido
lesado, sem interagirem com a biologia do organismo hospedeiro, ou seja, sendo
bioinertes. Como exemplos de materiais pertencentes a esta geração temos os metálicos
(por ex. aço inoxidável e titânio), cerâmicos (por ex. alumina e zircónia) e poliméricos
(por ex. polipropileno e polimetilmetacrilato) (Polo-Corrales et al. 2014). No entanto,
estes materiais desencadeiam a formação de uma camada de tecido fibroso à sua volta,
que dificulta a adesão do implante ao tecido receptor, podendo originar o seu
desprendimento (Anderson, 2001; Hench e Thompson, 2010).
Em 1984 emergiu um novo grupo de materiais, concebidos a partir da modificação dos
anteriores, através da incorporação de coberturas bioactivas ou biodegradáveis. Com o
uso das primeiras pretendia-se melhorar a resposta bionerte dos materiais antecessores e
obter uma acção biológica específica (osteocondução), para impedir a formação da
camada de tecido fibroso, melhorando a sua adesão ao tecido receptor (osteointegração).
Por outro lado, com os biodegradáveis o objectivo é que estes sofram uma progressiva
degradação ou solubilização, enquanto ocorre regeneração dos tecidos (Hench e Wilson,
14

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

1984; Navarro et al. 2008; Tabata, 2009). Com efeito, esta geração abrange dois tipos
de materiais, os bioactivos e os biodegredáveis. Nos primeiros enquadram-se os vidros
bioactivos, cerâmicos, vitro-cerâmicos e compósitos. Os segundos englobam os
polímeros sintéticos (poli (-caprolactona), poli (ácido láctico)) ou naturais (quitosano,
ácido hialurónico) (Navarro et al. 2008; Polo-Corrales et al. 2014).
Por fim, a terceira geração de biomateriais surgiu através da conjugação das
propriedades de bioactividade e biodegradabilidade, que marcaram a geração anterior,
com a capacidade de estimulação para actividades e procedimentos celulares específicos
(Hench e Polak, 2002). Foi também nesta geração que teve início o desenvolvimento de
matrizes porosas constituídas por materiais biomiméticos. Estes últimos estão
relacionados com a emergência da Engenharia de Tecidos, que tem como objectivo
obter materiais com características mecânicas apropriadas para o tecido em questão e
propriedades semelhantes às da matriz extracelular óssea nativa do paciente (Navarro et
al. 2008).

Figura 7: Evolução cronológica do desenvolvimento dos biomateriais utilizados na
reparação e regeneração óssea (Adaptado de Murugan e Ramakrishna, 2005).

15

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.2.1. Metálicos
Os metais são materiais com diversas aplicações em Ortopedia, tais como (Matassi et al.
2013; Navarro et al. 2008): o suporte de carga em dispositivos de fixação de fracturas e
de substituição de articulações; força, flexibilidade, dureza, aderência à fractura e
ductilidade, devido às suas propriedades mecânicas; biocompatibilidade; resistência à
corrosão.
No entanto, o uso de biomateriais metálicos apresenta alguns inconvenientes, tais como
(Alvarez e Nakajima, 2009; Matassi et al. 2013): a possível libertação de espécies
iónicas tóxicas resultantes do desgaste, corrosão ou dissolução sofridos após fricção e
interacção com o tecido adjacente, podendo provocar inflamação e reacções alérgicas,
que diminuem a biocompatibilidade e ocasionam a perda de tecido; a atenuada
estimulação ao desenvolvimento de osso novo; o desaparecimento do vigor mecânico
no local do implante, conduzindo à reabsorção óssea que determina a sua perda Uma
das formas de minimizar estas limitações é transformar estes materiais bioinertes em
bioactivos, de modo a permitir uma melhor interacção com o organismo e impulsionar a
adesão celular, através do revestimento superficial do dispositivo com materiais
bioactivos ou da sua modificação química (Navarro et al. 2008).
Entre os materiais metálicos mais utilizados destacam-se o aço inoxidável, as ligas
metálicas de cobalto-crómio e de titânio e o tântalo. Além das aplicações mencionadas
anteriormente estes materiais também podem ser utilizados na produção de estruturas
porosas no âmbito da engenharia de tecidos ósseos (por ex. uso de scaffolds à base de
titânio e tântalo ­ Figura 8), apesar do seu comportamento in vitro e in vivo ainda ser
pouco conhecido (Banhart, 2001, Matassi et al. 2013; Wu et al. 2008).

16

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 8: Scaffold metálico ­ (a) modelo de scaffold obtido pelo software de desenho
assistido por computador (b) scaffold de titânio (Peppo et al. 2012).

3.2.2. Cerâmicos
Estes materiais são usados em várias aplicações dentro da ortopedia, que vão desde a
reconstrução, substituição e reparação de tecidos lesados à elaboração de scaffolds
porosos de aplicação na área da engenharia de tecidos ósseos (Bose et al. 2013; Hench,
1991; Romagnoli et al. 2013).
Dentro deste grupo de materiais encontram-se dois tipos de cerâmicos (Bose et al. 2013;
Navarro et al. 2008): i) os bioinertes (por ex. alumina e zircónia), usados na constituição
de próteses articulares, por não sofrerem oxidação e corrosão em meio biológico e
apresentarem elevada dureza, reduzindo a fricção e o desgaste; ii) os bioactivos (por ex.
hidroxiapatite, fosfato tricálcico , vidros bioactivos e vitro-cerâmicos), utilizados no
preenchimento de perdas de substância óssea, revestimento de implantes metálicos
articulares e dispositivos para fixação óssea, por serem frágeis e possuírem uma fraca
resistência mecânica e também na produção de scaffolds.
Uma vez que o osso é maioritariamente constituído por hidroxiapatite, têm sido
investigados biomateriais que contenham na sua composição análogos ou indutores
químicos deste composto, com o intuito de tornar mais rápida a regeneração óssea
(Bose et al. 2012). Desta forma, numerosos scaffolds (Figura 9) à base deste composto
17

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

ou outros derivados de fosfato de cálcio têm sido construídos na medida em que
manifestam osteocondutividade, bioactividade e reabsorção in vivo. No entanto, estes
apresentam inconvenientes, como a sua estrutura quebradiça e a fraca estabilidade
mecânica, que limita a sua utilização em situações de grandes irregularidades ósseas
(Rezwan et al. 2006; Salgado et al. 2004).

Figura 9: Scaffolds de fosfato de cálcio (Yun et al. 2014).
Além dos scaffolds à base de materiais cerâmicos sintéticos, estes também podem ser
construídos à base de materiais cerâmicos de origem natural, como o coral, que revela
uma arquitectura porosa análoga à do osso trabecular, além da sua natureza orgânica
reduzir o risco de toxicidade e de reacções inflamatórias (Guillemin et al. 1989;
Hannouche et al. 2001).

3.2.3. Poliméricos
Os polímeros podem ser de origem natural ou sintética. Os naturais subdivide-se em três
classes, proteínas (por ex. colagénio, gelatina, fibrinogénio, elastina, actina, queratina,
miosina e proteínas da seda), polissacarídeos (por ex. celulose, amilose, dextrano,
quitina e glucosaninoglicanos) e polinucleótidos (por ex. ácido desoxirribonucleico
(Deoxyribonucleic Acid, DNA) e o ácido ribonucleico (Ribonucleic Acid, RNA). Entre
os

polímeros

sintéticos

destacam-se

os

polietilenos,

o

polimetilmetacrilato

(Polymethylmethacrylate, PMMA), os poli (-hidroxiácidos) ou poliésteres ((poli (ácido
láctico) (Polylactic Acid, PLA) e poli (ácido glicólico) (Polyglycolic Acid, PGA)),a policaprolactona (Poly (-Caprolactone, PCL)) e os poli (propileno fumaratos) (Proprylene
Fumarate, PPF) (Navarro et al. 2008; Yannas, 2004).
18

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Os compostos de origem natural normalmente são empregues na área da engenharia de
tecidos na construção de scaffolds aplicáveis a vários tecidos (por ex. osso, cartilagem,
ligamentos, meniscos e discos intervertebrais), devido à sua biocompatibilidade,
biodegradabilidade e bioactividade, com o intuito de suportarem o crescimento e
proliferação celular. No entanto, a sua utilização apresenta desvantagens, como reduzida
força mecânica, rejeições imunológicas devido a materiais derivados de fontes animais e
a possibilidade de conterem impurezas patogénicas.
Dos constituintes naturais acima referidos têm especial importância o colagénio (Figura
10), por se tratar de um dos componentes principais do tecido ósseo e o quitosano, que
também possui propriedades antibacterianas, curativas e bioadesivas, podendo os
scaffolds criados à base deste composto ser utilizados na fixação de péptidos que
cooperam na formação do osso (Aravamudhan et al. 2013; Costa-Pinto et al. 2011).
Relativamente aos polímeros sintéticos, os dois primeiros compostos (polietilenos e
PMMA) pertencem à primeira geração de biomateriais e são dos constituintes mais
utilizados em Ortopedia. Os polietilenos, polietileno de ultra-elevado peso molecular
(Ultrahigh Molecular Weight Polyethylene, UHMWPE) ou os polietilenos altamente
reticulados (cross-linking UHMWPE) são principalmente utilizados na composição de
dispositivos articulares, particularmente destinados à anca e joelho. Apesar da elevada
resistência ao choque, da biocompatibilidade e estabilidade química, o UHMWPE
quando em atrito com os diferentes biomateriais que compõem as próteses, sofre um
desgaste que resulta na libertação de partículas que podem originar reacções de
intolerância local e o consequente insucesso do implante. De forma a tentar colmatar ou
atenuar este processo surgiram os polietilenos altamente reticulados, em que a
reticulação reduz certas propriedades mecânicas deste material, como a sua resistência à
fadiga. Quanto ao PMMA, a sua utilização baseia-se na fixação de próteses de
substituição articular e preenchimento de perdas de substância óssea. A sua aplicação
apresenta alguns inconvenientes, tais como o efeito exotérmico no momento da sua
colocação, que pode resultar na necrose do tecido circundante; contracção durante a
polimerização, conduzindo a fissuras, provocando a perda de ligação entre si e o
dispositivo; oscilações na sua rigidez, que podem originar a sua quebra e subsequente
libertação de partículas, que ao interagirem com os tecidos induzem uma resposta
inflamatória (Mano et al. 2004; Navarro et al. 2008).
19

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Em relação aos restantes materiais poliméricos, estes já integram a segunda e terceira
gerações de biomateriais e, apesar de possuírem também aplicações no âmbito da
cirurgia ortopédica, são maioritariamente usados na área da engenharia de tecidos na
preparação de scaffolds. Esta utilização deve-se ao facto de existir um maior controlo
das suas propriedades físico-químicas, comparativamente à dos polímeros de origem
natural, melhores e reprodutíveis características mecânicas e de degradação
(Dhandayuthapani et al. 2011; Navarro et al. 2008; Slaughter et al. 2009).
Os polímeros são também usados na formação de hidrogeles, que possuem a capacidade
de retenção de elevadas quantidades de água de forma a reproduzir o ambiente da matriz
extracelular de tecidos moles e fornecer os agentes bioactivos necessários à estimulação
da regeneração de tecidos. Contudo, estes sistemas apresentam baixa força mecânica, o
que dificulta o seu manuseamento (Kirschner e Anseth, 2013; Lee e Mooney, 2001; Liu
e Ma, 2004; Navarro et al. 2008; Vagaská et al. 2010).

Tabela 1: Exemplos de polímeros naturais e sintéticos aplicados em engenharia de
tecidos (Adaptado de Salgado et al. 2004).
Material

Origem

Colagénio

Natural

Características
-Baixo potencial imunogénico,
quimiostático e bom substrato para
adesão celular
- Scaffolds com baixas propriedades
mecânicas

Fibrina

Natural

-Promove migração celular e
vascularização

Quitosano

Natural

-Hemostático e promove
osteocondução e cura das lesões

Amido

Natural

- Comportamento termoplástico, bom
substrato para adesão celular,
não citotóxico e biocompativel
- Ligação ao osso quando reforçado
com hidroxiapatite
- Scaffolds com boas propriedades
mecânicas

Ácido hialurónico

Natural

20

- Mínima imunogenicidade

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo
- Quimiostático quando combinado
com agentes apropriados
- Scaffolds com baixas propriedades
mecânicas
Poli (hidroxibutirato)

Natural

- Substrato adequado para crescimento
ósseo mas possui uso limitado devido
à sua natureza quebradiça

Poli (-hidroxiácidos)

Sintética

- Poliésteres alifáticos extensivamente
estudados, degradados por hidrólise,
podem apresentar problemas
relativamente à biocompatibilidade e
citotoxicidade na área circundante ao
local da implantação

Poli (-caprolactona)

Sintética

- Poliéster alifático
- Degradado por hidrólise ou erosão
- Baixa versatilidade química
- Alguns problemas relacionados com
a resistência mecânica a cargas

Poli (propileno fumaratos)

Sintética

- Poliésteres insaturados alternados de
propilenoglicol e ácidos fumáricos
- Resultados biológicos satisfatórios

Poli (fosfazenos)

Sintética

- Degradação através de hidrólise

Poli (anidridos)

Sintética

- Principalmente desenvolvido para
distribuição de fármacos, é
biocompatível e suporta regeneração
óssea endosteal e cortical

Figura 10: Scaffolds de colagénio (Kanayama et al. 2014).

21

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.2.4. Compósitos
Um material compósito é constituído por pelo menos duas fases, uma contínua e outra
dispersa. A primeira é a fase aglomerante, que se encarrega da ocupação do volume e da
transposição de carga para a fase dispersa, que é mais rígida e resistente, tendo a função
de melhorar algumas das propriedades do compósito (Mano et al. 2004).
Estes compostos surgiram com o intuito de superar as limitações dos biomateriais,
usando-se uma combinação de diferentes tipos de biomateriais, de forma a obter as
vantagens inerentes de cada um, através de um efeito sinérgico. Deste modo, as
propriedades dos compósitos são únicas e diferentes das dos materiais em separado. As
suas aplicações passam pela construção de scaffolds alusivos à engenharia de tecidos
ósseos (Figura 11), uma vez que o próprio tecido ósseo é considerado um compósito
natural, pois é constituído pela mistura de cristais inorgânicos de hidroxiapatite e fibras
orgânicas de colagénio (Chen et al. 2012; Porter et al. 2009; Vagaská et al. 2010). Estes
scaffolds são construídos a partir de diferentes matrizes, como por exemplo, a
conjugação de polímeros com biomateriais cerâmicos, biomateriais cerâmicos
associados a metálicos ou a mistura de polímeros com metais (Mano et al. 2004).
Destas junções destacam-se os compósitos de polímeros e cerâmicos, pois aliam a
tenacidade dos polímeros com a força de compressão dos cerâmicos, semelhante à do
tecido ósseo. Obtêm-se assim scaffolds bioactivos com notáveis características
mecânicas e boas taxas de degradação (Porter et al. 2009; Stevens, 2008).

Figura 11: Scaffold poroso constituído por um material compósito (hidroxiapatite/ácido
poli (láctico-co-glicólico)) (Chen et al. 2013).
22

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3. Scaffolds
Como já referido, a engenharia de tecidos ósseos tem vindo a desenvolver uma
alternativa promissora para a reparação de lesões ósseas, designada por scaffolds no
sentido de colmatar as limitações da terapêutica em curso (Dimitriou et al. 2011; Ikada,
2006).
O uso dos scaffolds prende-se com o facto do osso ser um tecido tridimensional activo
mas quando isoladas in vitro, as suas células não adquirem essas conformações em 3D.
Assim os scaffolds proporcionam um ambiente adequado para a suas células se
agregarem, proliferarem, diferenciarem e permitirem a deposição da nova matriz
extracelular óssea (Costa-Pinto et al. 2011). Estas estruturas são constituídas pelos
diferentes biomateriais, sendo que para conseguir alcançar a regeneração óssea deverão
possuir algumas características físicas e biológicas fundamentais, tais como:


Biocompatibilidade, que se traduz na capacidade do biomaterial e dos seus
produtos de degradação não provocarem uma resposta inflamatória no paciente
nem demonstrarem imunogenicidade ou citotoxicidade (Williams, 2008).



Biodegradabilidade controlada e ajustada de forma a garantir o suporte
estrutural necessário para a regeneração completa do tecido em questão (CostaPinto et al. 2011).



Estrutura porosa interligada e arquitectada através da associação de macro e
microporos, que facilita o crescimento do tecido, a vascularização, melhora o
transporte de nutrientes e oxigénio e a remoção de resíduos. Contudo, uma
elevada porosidade reduz significativamente as propriedades mecânicas do
scaffold, pondo em causa a sua integridade estrutural (Bose et al. 2012; Liu e
Ma; 2004; Navarro et al. 2008). Outro factor importante são as dimensões do
poro, que estão directamente relacionadas com a vascularização, uma vez que
poros de tamanho maior depressa se vascularizam, estimulando directamente a
osteogénese. Por outro lado, os poros mais pequenos têm mais dificuldades de
vascularização, resultando em situações de hipoxia, que conduzem a um
processo osteocondral antes da osteogénese ocorrer. O tamanho mínimo aceite
é 100-150µ (Costa-Pinto et al. 2011; Ikada, 2006).

23

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo



Propriedades mecânicas que garantam o suporte estrutural durante o
manuseamento e as actividades normais do paciente (Chen et al. 2012). As
características mecânicas devem ser semelhantes às do tecido nativo
destacando-se a rigidez, a força e resistência às tensões sofridas in vivo até que
o novo tecido formado ocupe a matriz do scaffold (Alvarez e Nakajima, 2009).



Osteocondutividade e osteoindução que permitirão ao scaffold a adesão e
proliferação das células ósseas e a geração da matriz extracelular óssea na sua
superfície porosa (Bose et al. 2012).



Estrutura anisotrópica que lhe possibilita adaptar-se às formas anatomicamente
exactas (Romagnoli e Brandi, 2014).

3.3.1. Tipos de scaffolds
Entre as classes de biomateriais referidas anteriormente, os polímeros naturais e
sintéticos são os mais utilizados na preparação destas matrizes em estruturas 3D.
Existem diferentes formas de matrizes (Figura 12), destacando-se os típicos scaffolds
porosos na forma de espuma sólida, os hidrogeles, os scaffolds fibrosos à base de
nanofibras e os scaffolds constituídos por microesferas (Dhandayuthapani et al. 2011).

Figura 12: Exemplos das diferentes formas de scaffolds poliméricos em engenharia de
tecidos (Chung e Park, 2007).

24

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3.2. Técnicas de produção de scaffolds
As diferentes técnicas de preparação de scaffolds conferem-lhes diferentes propriedades
estruturais, pelo que a escolha do método de produção terá de entrar em linha de conta
com os requisitos necessários e a finalidade da sua aplicação (Yang et al. 2001).
As estruturas porosas em 3D são fundamentais em engenharia de tecidos pois
proporcionam um suporte capaz de comportar células reparadoras e factores de
crescimento ambos essenciais à recuperação de tecidos lesados (Alvarez e Nakajima,
2009).
A Tabela 2 resume as vantagens e desvantagens resultantes da aplicação das diversas
técnicas usadas na produção dos diferentes tipos de scaffolds.
Tabela 2: Vantagens e desvantagens dos diferentes tipos de scaffolds (Adaptado de
Musumeci et al. 2014).
Scaffolds

Vantagens

Porosos pelas técnicas
tradicionais

Elevada porosidade, estrutura
interligada e
simples e fáceis de produzir

Porosos pelas técnicas
modernas
Hidrogeles

Arquitectura da matriz controlada:
tamanho, forma, interligação,
geometria e orientação, controlo
dos poros e das suas dimensões e
propriedades mecânicas e
degradação controladas
Flexibilidade e viscoelasticidade

Fibrosos

Fáceis de produzir, elevada área de
superfície e elevada distância entre
as fibras para a nutrição e troca de
oxigénio

Microesferas

Arquitectura e variações
composicionais reprodutíveis

25

Desvantagens
Uso de solventes altamente
tóxicos, baixa interligação dos
poros, dificuldade em cultivar
células homogeneamente após
produção e possibilidade de
manifestarem fracas propriedades
mecânicas

Uso restrito a materiais
poliméricos seleccionados

Hidrogeles de polímeros naturais
podem induzir respostas
inflamatórias e baixa resolução
Fraca integridade mecânica e
poros pequenos que limitam a
infiltração das células e a sua
integração com o tecido receptor
após implantação
Difíceis de remover uma vez
injectadas ou implantadas

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3.2.1. Técnicas tradicionais para a produção de scaffolds porosos
Na elaboração de scaffolds porosos as primeiras técnicas foram a formação de espumas
gasosas ou químicas (Figuras 13 e 14), a liofilização, a evaporação de
solvente/lixiviação de partículas e a separação de fase (Amini et al. 2012; Liu e Ma,
2004). A primeira técnica permite produzir espumas de polímeros bastante porosos sem
recorrer a solventes orgânicos. O processo envolve a saturação de dióxido de carbono
ou azoto em discos de polímeros produzidos num molde a elevadas temperaturas. Estes
discos são sujeitos a elevadas pressões destes gases numa câmara durante alguns dias
que, com o passar do tempo, são reduzidas até à pressão atmosférica. Após a sua
libertação cria-se uma instabilidade termodinâmica que origina a nucleação e a geração
de macroporos. Esta técnica apresenta como desvantagens a baixa interligação entre os
poros, o facto de os poros serem fechados e reduzidas propriedades mecânicas. Uma
forma de melhorar a ligação dos poros é a conjugação deste método com a técnica de
lixiviação de partículas descrita mais à frente (Harris et al. 1998; Liu e Ma, 2004; Mikos
e Temenoff, 2000; Salgado et al. 2004).

Figura 13: Técnica da formação de espumas gasosas (Garg et al. 2012).

26

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 14: Scaffold obtido por formação de espumas gasosas (Nazarov et al. 2004).
A formação de scaffolds por liofilização (Figuras 15 e 16) baseia-se na dissolução de
uma solução polimérica num solvente orgânico, seguida da adição de água e
subsequente remoção dos solventes por sublimação sob o vazio. Tal como o método
anterior, estas estruturas 3D exibem poros fechados e baixa estabilidade mecânica
(Mikos e Temenoff, 2000; Salgado et al. 2004).

Figura 15: Esquema representativo da técnica de liofilização (Garg et al. 2012).

27

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 16: Scaffolds preparados por liofilização (Sultana e Wang, 2011).
A técnica de evaporação de solvente/lixiviação de partículas é a mais utilizada para
preparação de scaffolds. Este método foi relatado pela primeira vez em 1994 por Mikos
e os seus colaboradores. Trata-se de um processo simples que consiste uma mistura de
cristais de sais solúveis (por ex. cloreto de sódio, tartarato de sódio, citrato de sódio) ou
partículas orgânicas (por ex. sacarose numa solução polimérica), que posteriormente é
vertida para um molde com a forma pretendida, onde se procederá à eliminação do
solvente por evaporação ou liofilização. De seguida, as partículas que sobram são
lixiviadas através de uma malha porosa, obtendo-se uma gama de diâmetros específicos
dos poros. Este procedimento possui como limitações a utilização de solventes
orgânicos tóxicos e a dificuldade em extrair as partículas solúveis do interior da matriz
polimérica, o que confina à geração de membranas finas com tamanhos até 3mm (Liu e
Ma, 2004; Mikos et al. 1994; Hutmacher, 2000; Salgado et al. 2004; Yang et al. 2001).

Figura 17: Representação da técnica evaporação de solvente/lixiviação de partículas
(Adaptado de Garg et al. 2012).
28

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 18: Scaffolds obtidos pelo método de lixiviação de partículas (Asti et al. 2010).

O método de separação de fase baseia-se na dissolução de um polímero num solvente
(por ex. fenol, naftaleno, ou dioxano) a elevada temperatura, seguida de um
arrefecimento rápido, que origina a divisão do composto numa fase líquido-líquido ou
sólido-líquido consoante a sua natureza e os valores da temperatura usada e posterior
exclusão do solvente por sublimação. Esta técnica permite a produção de scaffolds
porosos. Contrariamente às técnicas descritas anteriormente, os scaffolds obtidos
exibem boas características mecânicas. No entanto, os poros gerados são de pequenas
dimensões (Mikos e Temenoff, 2000; Yang et al. 2001).

Figura 19: Método da separação de fase conforme a divisão do composto numa fase
líquido-liquido (A) ou sólido-líquido (B) (Garg et al. 2012).
29

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 20: Scaffolds preparados por separação de fase (Martinez-Pérez et al. 2011).

3.3.2.2. Técnicas modernas para a produção de scaffolds porosos
Com o progresso da tecnologia surgiram novas metodologias baseadas no conceito de
produção assistida, que foi primeiramente inserido por Chuck Hull, em 1986, através de
um método designado por estereolitografia (Hull, 1986). Estas novas técnicas
conhecidas por prototipagem rápida ou fabrico sólido livre são computarizadas e regemse por três princípios (Amini et al. 2012; Bose et al. 2013): i) o uso de um software de
desenho assistido por computador (Computer Assisted Design) para a criação de um
protótipo virtual, com a geometria e porosidade pretendidas para o scaffold a ser
construído; ii) a transfiguração do protótipo criado em contínuas camadas através de um
software de execução assistida por computador (Computer Assisted Manufacturing); iii)
a elaboração do scaffold fundamentada na concepção de camada por camada pela adição
de várias porções de material.
As técnicas de prototipagem rápida foram desenvolvidas com o intuito de preparar
scaffolds personalizados para cada paciente, sendo particularmente importantes na
reparação das lesões mais complicadas.
Entre estas destacam-se a impressão a três dimensões (3D Priting), a modelagem por
fusão e deposição (Fused Deposition Modeling), a sinterização a laser (Selective Laser
Sintering) e a estereolitografia (Melchels et al. 2010).
A impressão a três dimensões (Figura 21) foi desenvolvida no início da década de
noventa, no Instituto de Tecnologia de Massachusetts, por Sachs e os seus
colaboradores. Trata-se de uma técnica que aplica a impressão a jacto de tinta de um
ligante no procedimento de materiais em pó (Sachs et al. 1992; Hutmacher, 2000).

30

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Antes do início do processo, parâmetros como a densidade, fluidez e molhabilidade do
pó, a espessura das camadas e o volume e saturação do ligante são optimizados para
aumentar a qualidade do produto produzido. Este método permite a orientação do
padrão do scaffold na área de fabrico através de um software de execução assistida por
computador. O funcionamento da técnica inicia-se com a deposição de uma porção de
pó uniforme na camada de alimentação, que posteriormente é dispersa por um rolo de
nivelamento, para a camada de construção. De seguida, a cabeça de impressão pulveriza
o ligante (pode ser de origem orgânica ou polimérica) sobre o pó, levando à ligação das
partículas entre si na zona de produção. Após estes procedimentos, a camada de
alimentação sobe enquanto a de construção desce, com o auxílio dos seus pistões, para
delinear a espessura de uma nova camada de pó a ser depositada, seguida da adição do
ligante, que depois é seco. Este mecanismo repete-se várias vezes até que o scaffold
pretendido seja construído. A próxima etapa passa pela remoção do excesso de pó do
scaffold por acção de ar comprimido (Bose et al. 2013). Esta metodologia permite o
desenvolvimento de produtos com geometrias complexas (Figuras 21 e 22) num curto
espaço de tempo a partir de modelos gerados pelo software de desenho assistido por
computador e a incorporação de factores de crescimento. No entanto, apresenta como
limitações o facto da porosidade do scaffold ser dependente da granulometria do pó e
apresentação de poros fechados, a utilização de solventes orgânicos como ligantes e
reduzidas características mecânicas (Liu e Ma, 2004).

Figura 21: Sistema usado na impressão a três dimensões (Bose et al. 2013).
31

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 22: Scaffolds produzidos pela técnica de impressão a três dimensões (Tarafder et
al. 2012).

A técnica da modelagem por fusão e deposição envolve a incorporação de um material
fundido depositado em camadas ultra-finas. O princípio da técnica baseia-se na
utilização de dois filamentos de material, um de construção e outro de suporte, que são
movidos por dois cilindros rotativos, controlados pelo software de execução assistida
por computador e uma extremidade que é aquecida para derreter o material, que compõe
a cabeça de extrusão (Figura 23). Por sua vez, é esta que procede à extrusão da matéria
fundida, que rapidamente solidifica e se deposita em camadas. Posteriormente a
plataforma de construção desce para a adição de uma nova camada, repetindo-se este
processo sucessivamente. A sua principal vantagem é a não utilização de solventes
orgânicos. Contudo, a impossibilidade de associar factores de crescimento, as
temperaturas elevadas e a gama restrita de polímeros passíveis de aplicação constituem
inconvenientes (Hutmacher, 2000; Salgado et al. 2004). As Figuras 23 e 24 representam
o princípio de funcionamento e um exemplo de um scaffold obtido pela técnica da
modelagem por fusão e deposição.

32

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 23: Funcionamento da técnica da modelagem por fusão e deposição (Zein et al.
2002).

Figura 24: Scaffold sintetizado pela técnica da modelagem por fusão e deposição
(Bergmann et al. 2014).
33

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

O método de sinterização a laser aplica um laser de dióxido de carbono para a fusão de
variados materiais em pó (por ex. cera, policarbonato, cerâmicos e polímeros, como o
nylon) ou seus compósitos e metais, na construção do scaffold pretendido. Tal como na
impressão a três dimensões, o funcionamento desta técnica também tem início com a
deposição de uma camada de pó com o auxílio de um rolo de nivelamento. Neste caso,
quem se dispersa pela área de construcção de forma a reproduzir a informação contida
no software de desenho assistido por computador é o laser e não um ligante (Figura 25).
Após terminada a primeira camada a plataforma de construção desce para a
incorporação de uma nova camada, repetindo-se este processo continuamente. Com o
objectivo de evitar a degradação dos materiais utilizados e proporcionar a introdução de
agentes bioactivos ou células, pode ser efectuada uma alteração a esta técnica, através
de um processo designado por sinterização selectiva a laser de superfície (Surface
Selective Laser Sintering) (Antonov et al. 2004; Duan et al. 2010; Yang et al. 2002). As
Figuras 25 e 26 ilustram, respectivamente, o princípio da técnica e um exemplo de um
scaffold obtido pelo método de sinterização a laser.

Figura 25: Mecanismo da técnica de sinterização a laser (Kathuria, 1999).

Figura 26: Scaffolds produzidos pelo método de sinterização a laser (Duan et al. 2010).
34

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Como referido, a técnica da estereolitografia foi a primeira das metodologias de
produção de scaffolds a ser comercializada. Embora a partir do seu surgimento tenham
sido desenvolvidos novos métodos, este continua a ser dos mais versáteis e eficazes,
exibindo uma exactidão superior, pois é capaz de produzir objectos de 20 , enquanto as
outras produzem na gama 50-200 . Com efeito, o funcionamento da técnica da
estereolitografia baseia-se na solidificação de uma resina líquida num padrão por
fotopolimerização, que resulta da incidência de raios ultravioleta de um laser ou de luz,
a partir de um projector digital controlado por um software de computador que conduz à
aderência à plataforma de suporte, formando uma camada de uma espessura delineada.
Após a fotopolimerização da primeira camada de resina, a plataforma desce à distância
equivalente à espessura anterior e ocorre nova adição de resina, para se formar a camada
seguinte e assim sucessivamente (Melchels et al. 2010). Na Figura 27 são
exemplificados os processos envolvidos na técnica da estereolitografia.

Figura 27: Processos envolvidos na produção de estruturas por estereolitografia
(Adaptado de Melchels et al. 2010).

35

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3.2.3. Técnicas de produção de scaffolds à base de hidrogeles
Outra forma de preparação dos scaffolds é com recurso a sistemas de hidrogeles, que
podem ser de origem natural ou sintética.

Figura 28: Funcionamento de hidrogeles injectáveis como scaffolds (Tan e Marra,
2010).

As primeiras técnicas desenvolvidas no âmbito da utilização de hidrogeles foram a
polimerização de radicais livres e a adição de Michael. O primeiro método é
caracterizado pela utilização de luz ultravioleta para a formação de radicais livres
passíveis de serem usados na polimerização de vários grupos funcionais na produção de
hidrogeles. Apresenta como vantagem a facilidade em polimerizar in situ e criar uma
excelente cinética de gelificação. Por outro lado, o processo da adição de Michael é
estabelecido pela conjugação de reacções de adição como as de diferentes grupos
funcionais com materiais poliméricos, ou entre diferentes macrómeros (Selimovi et al.
2012; Slaughter et al. 2009; Tan e Marra, 2010; Ward e Peppas, 2000).
A maior vantagem deste tipo de scaffolds, produzidos in situ, é o facto de estes puderem
ser administrados via injectável associados a células e a factores de crescimento em
solução. Após a administração, funcionam como sistemas de libertação prolongada das
células no local da lesão (Chung e Park, 2007).

36

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Com o intuito de criar hidrogeles capazes de simular as funcionalidades e as
características dos tecidos do organismo, surgiram técnicas avançadas que permitem a
produção de geles à microescala (i.e. microgeles) (Figuras 29 e 30). Estas incluem a
emulsificação, micromodelação, fotolitografia, técnicas microfluídicas e impressão de
gel (Slaughter et al. 2009).
A emulsificação é uma metodologia empregue com a finalidade de produzir
microesferas de hidrogel, que permitem efectuar trocas de oxigénio, nutrientes e
produtos metabólicos entre as células e o ambiente circundante. Estas microesferas são
produzidas a partir da dispersão de uma solução de um polímero de natureza
hidrofóbica num solvente adequado, seguida da evaporação do mesmo solvente. A
formação das microesferas acontece devido à volatilidade do solvente, que ao ser
evaporado lentamente da emulsão, leva à precipitação do polímero (Slaughter et al.
2009).
O método da micromodelação baseia-se na criação de um molde responsável pela forma
do hidrogel, seguida da reticulação do mesmo, em que um precursor de um determinado
polímero no estado líquido preenche o molde, que é pressionado, excretando o líquido
em excesso. Posteriormente ocorre a sua solidificação, mas mantém-se aderente ao
molde até este ser removido (Selimovi et al. 2012).
O processo da fotolitografia envolve exposição de luz sobre os precursores do hidrogel
nas áreas específicas em que serão reticulados. Neste mecanismo para se proceder à
incorporação de células é necessário que estas sejam previamente suspensas num
precursor do polímero, devido à citotoxicidade do fotoiniciador e da exposição de luz
ultravioleta. Outra vertente deste procedimento é a utilização de luz proveniente de laser
para reticular polímeros hidrofílicos fotoactivos através de um método designado por
litografia de varrimento a laser (Laser Scanning Lithography) (Selimovi et al. 2012;
Slaughter et al. 2009).
As técnicas microfluídicas baseiam-se numa série de metodologias que têm o objectivo
de preparar hidrogeles com fluxos simples ou multifásicos em canais microfluídicos,
utilizados para encapsular células no interior de gotículas de soluções de polímeros
(Selimovi et al. 2012; Slaughter et al. 2009).

37

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

A impressão de gel é uma técnica que permite produzir tecidos tridimensionais in vitro
a partir de microgeles associados a células. Tal como metodologias anteriores, envolve a
deposição camada por camada das células no interior de um gel tridimensional
controlada por um software de desenho assistido por computador (Mironov et al. 2003;
Selimovi et al. 2012; Slaughter et al. 2009).

Figura 29: Técnicas usadas na produção de microgeles (Slaughter et al. 2009).

38

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Figura 30: Exemplos de microgeles com diferentes formas (Yeh et al. 2006).

3.3.2.4. Técnicas de produção de scaffolds fibrosos
Os scaffolds ainda podem ser do tipo fibroso, constituídos por redes de nanofibras
provenientes de vários polímeros, aptas para retratarem a arquitectura da matriz
extracelular óssea, e por uma estrutura microporosa. Em conjunto, estas estruturas
promovem a adesão, a proliferação e a diferenciação celular. Actualmente a produção
destas fibras ocorre recorrendo-se às técnicas da auto-montagem, da separação de fase e
electrofiação (Dhandayuthapani et al. 2011).
O método de auto-montagem (Figuras 31 e 32) é um procedimento laboratorial
inspirado na organização própria de várias moléculas existentes na natureza, como
proteínas e péptidos ou na disposição das moléculas de colagénio na matriz extracelular
óssea. O objectivo é produzir estruturas nanofibrosas através do desenvolvimento de
materiais capazes de se difundirem espontaneamente, em um modelo passível de
reproduzir as características estruturais dos sistemas biológicos. As unidades mais
utilizadas na construção destas estruturas são os péptidos anfifilicos (Smith et al. 2008;
Zhang, 2003). O processo de auto-montagem é usado para formar estruturas ordenadas e
39

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

estáveis, mantidas por interacções não covalentes, como as interacções hidrofóbicas, de
van der Waals, electrostáticas e as ligações de hidrogénio (Rajagopal e Schneider, 2004;
Zhang, 2003). Apesar de conduzir à produção de nanofibras com poros de tamanhos
homogéneos, trata-se de um procedimento complexo e de produção em pequena escala.
Os scaffolds resultantes são mecanicamente frágeis e o tamanho e estrutura dos seus
poros e a sua taxa de degradação não são controláveis (Chen et al. 2013; Smith et al.
2008; Vasita e Katti, 2006).

Figura 31: Técnica de auto-montagem utilizando péptidos anfifilicos (Zhang et al.
2012).

Figura 32: Scaffold fibroso preparado pela técnica de auto-montagem (Ahirwal et al.
2013).

40

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

A separação de fase (Figuras 33 e 34) é um método desenvolvido por Ma e Zhang, que
surgiu na tentativa de reproduzir a estrutura tridimensional das fibras de colagénio que
compõem a matriz extracelular óssea. Esta metodologia consiste na dissolução de um
polímero em solução seguida da separação termodinâmica da fase líquido-líquido.
Posteriormente é adicionado um solvente para favorecer a formação de um gel. Após
arrefecimento do gel é efectuada a liofilização para eliminar o solvente, levando à
produção do scaffold. (Ma e Zhang, 1999; Martinez-Pérez et al. 2011). Contrariamente
à técnica anterior, este é um procedimento simples que não recorre a equipamento
especializado, embora a sua produtividade também esteja restrita à escala laboratorial.
No entanto, a estrutura macroporosa resultante pode ser controlada pela incorporação de
porógeneos (partículas de forma e tamanho específicos usadas para criar poros nas
estruturas em Engenharia de Tecidos) no decorrer da etapa da separação (Jayaraman et
al. 2004; Kim et al. 2009; Smith e Ma, 2004).

Figura 33: Esquema representativo da técnica de separação de fase. O polímero (a) é
dissolvido no solvente (b) formando uma solução (c) que é rapidamente arrefecida,
induzindo e conduzindo à separação de fases (polímero e solvente) (d). Posteriormente
o solvente é removido (e), formando-se uma rede de nanofibras (Dahlin et al. 2011).

Figura 34: Rede de nanofibras obtida pela técnica de separação de fase (Samitsu et al.
2013).

41

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

A metodologia da electrofiação (Figuras 35 e 36) é a mais estudada e compreende a
aplicação de um campo eléctrico para induzir a criação e o acondicionamento das fibras
de vários materiais num colector metálico, estático ou rotativo. Este procedimento
inicia-se com a manutenção de uma solução polimérica na extremidade de uma agulha
graças à tensão de superfície, recorrendo-se a uma alta voltagem para gerar um campo
eléctrico que vai originar uma repulsão de cargas no interior da solução. Esta repulsão
conduz à oposição da tensão superficial até a ultrapassar, formando-se um jacto que se
dirige até ao colector. Durante a movimentação do jacto, ocorre a evaporação do
solvente e o desenvolvimento das fibras que serão aí dispostas (Barnes et al. 2007;
Dhandayuthapani et al. 2011; Pham et al. 2006). O uso desta técnica permite a produção
de redes de fibras à micro e nano escala, em que estas últimas apresentam elevada
porosidade e área de superfície, mas exibem baixas características mecânicas, de
biodegradabilidade e osteocondutividade, que podem ser melhoradas pela incorporação
ou revestimento de partículas cerâmicas nos scaffolds (Vasita e Katti, 2006).

Figura 35: Funcionamento da técnica de electrofiação (Barnes et al. 2007).

Figura 36: Scaffold fibroso obtido por electrofiação (Adaptado de Jin et al. 2012).
42

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3.2.5. Técnicas de produção de scaffolds à base de microesferas
A produção de scaffolds baseados em microesferas (Figura 37) é usada para
administração injectável, com o objectivo de proporcionar suporte ao crescimento
celular e funcionar como um transportador de factores de crescimento, aumentando a
proliferação e propagação celular (Makhaik, 2013). Além disso, as microesferas podem
também ser incorporadas nas matrizes porosas convencionais, em combinação com
células e factores de crescimento, para obter uma libertação prolongada dessas
moléculas sem comprometer as características do scaffold. As microesferas podem
ainda aumentar a porosidade dos biomateriais que compõem os scaffolds e melhorar as
suas propriedades mecânicas (Mouriño e Boccaccini, 2010; Wang et al. 2012). São
unidades de produção fácil e permitem o controlo da morfologia e das características
físico-químicas dos scaffolds. Alguns dos métodos empregues na elaboração de
microesferas são a sinterização a quente, tratamentos de vapores de solventes e o
método de sinterização. Estas técnicas envolvem a exposição a altas temperaturas ou o
uso de solventes orgânicos, o que pode restringir a suas aplicações (Brown et al. 2008;
Jacklenec et al. 2008; Nukavarapu et al. 2008).

Figura 37: Distribuição de células tronco a partir de microesferas nanofibrosas (Zhang
et al. 2012).
43

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

3.3.2. Células, factores de crescimento e vascularização
Como referido ao longo deste trabalho, a preparação de scaffolds no âmbito da
Engenharia de Tecidos surgiu como uma estratégia para aumentar a capacidade de
reparação e regeneração óssea. Para estimular e melhorar os processos são adicionadas
células ósseas percursoras e factores de crescimento aos scaffolds aliados a uma
vascularização capaz de facilitar o acesso aos nutrientes e oxigénio necessários (Amini
et al. 2012).
As células mais usadas são as células tronco mesênquimais, extraídas da medula óssea
do paciente. Estas são cultivadas in vitro para proliferar e mais tarde serem
reimplantadas no paciente (Alvarez e Nakajima, 2009). Com o intuito de melhorar o
desempenho das células osteogénicas in vitro, são utilizados biorreactores que
pretendem simular o ambiente dinâmico e mecânico in vivo (Bancroft et al. 2003). Estes
são sistemas automatizados que, além de reproduzirem o ambiente in vivo das células,
também permitem a produção automática e padronizada de tecidos com custos
reduzidos, o que favorece o uso da Engenharia de Tecidos em larga escala. Neste
sentido, podem ser usados diferentes tipos de biorreactores (Figura 38), destacando-se
os de tanque agitado, os de tanque tubular e os abertos (Amini et al. 2012).

Figura 38: Biorreactores utilizados em Engenharia de Tecidos ósseos: (A) ­
Biorreactor de tanque agitado; (B) ­ Biorreactor de tanque tubular; (C) ­ Biorreactor
aberto (Adaptado de Martin et al. 2004).
O biorreactor de tanque agitado (Figura 38 A) é o tipo mais simples e económico. O
funcionamento deste sistema baseia-se na formação de forças de convecção a partir de
uma barra magnética, que permite a mistura contínua de meio com os scaffolds
44

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

incorporados com células, que se encontram presos a agulhas suspensas na tampa do
biorreactor. (Amini et al. 2012; Sikavitsas et al. 2002; Stiehler et al. 2009). O
biorreactor de tanque tubular (Figura 38 B) permite a manutenção das células num
estado de microgravidade, devido à constante rotação, que evita a deposição das células,
ao mesmo tempo que impulsiona as interacções entre elas (Sikavitsas et al. 2002). O
biorreactor aberto (Figura 38 C) é o mais utilizado. É constituído por uma câmara que
alberga os scaffolds incorporados com as células e por uma bomba que coloca os
scaffolds em contacto com o meio de cultura. Este mecanismo não só possibilita uma
distribuição homogénea das células pelos scaffolds, como também aumenta a sua
densidade, proliferação, diferenciação e deposição da matriz extracelular óssea no
scaffold (Bancroft et al. 2003; Goldstein et al. 2001).
Uma estratégia utilizada para aumentar o crescimento ósseo que realça o potencial
osteoindutivo e osteocondutivo das células percursoras contidas nos scaffolds é a adição
de factores de crescimento (Hughes et al. 2006). Estes são polipéptidos sintetizados e
libertados em quantidades fisiológicas, que funcionam como reguladores locais da
acção das células estando presentes naturalmente na matriz óssea saudável sendo
também libertados durante o processo de reparação da lesão, para induzir a
diferenciação das células ósseas (Solheim, 1998).
Além das células e dos factores de crescimento, outro factor importante no desempenho
dos scaffolds é a vascularização. Se esta for inadequada ou escassa pode originar
diferenciação celular irregular ou morte celular, por falta de nutrientes e oxigénio (Bose
et al. 2012). Para melhorar e acelerar a criação de novos vasos sanguíneos foram
desenvolvidos vários métodos, tais como (Amini et al. 2012; Huang et al. 2005): o
aumento do tamanho e da interligação dos poros recorrendo-se a novas técnicas de
produção de scaffolds referidas anteriormente; a inclusão de factores de crescimento
angiogénicos nos scaffolds; a inclusão de factores de crescimento angiogénicos nas
células cultivadas in vitro, previamente modificadas geneticamente, ocorrendo a
libertação simultânea de factores osteogénicos e angiogénicos. Esta última técnica é
mais eficaz na formação de vasos sanguíneos e na regeneração óssea, comparativamente
à libertação de factores de crescimento isolados e à necessidade de utilizar factores de
crescimento recombinantes de elevado custo, para modificar geneticamente as células.
Podem ainda ser usadas técnicas in vitro e in vivo de pré-vascularização. As técnicas in
45

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

vitro recorrem à cultura de células endoteliais em conjunto com células osteogénicas em
scaffolds. A interacção entre os dois tipos de células conduz à criação de vasos imaturos
por parte das células endoteliais, que poderão maturar e recombinar com a
vascularização do paciente, após implantação. Esta estratégia além de acelerar a
vascularização in vivo, aumenta a diferenciação das células osteoprogenitoras in vitro e
a criação de osso novo in vivo (Buschmann et al. 2011; Fuan et al. 2014). A prévascularização in vivo pode ser realizada por dois modos distintos. No primeiro, o
scaffold é introduzido em tecido vascular axial, resultando na geração de uma rede
microvascular no interior do scaffold, após algumas semanas. Posteriormente esta
matriz tridimensional é transferida para o local da lesão, sendo a sua rede ligada por um
procedimento cirúrgico, designado por técnica de anastomose vascular microcirúrgica.
Este processo apresenta como desvantagens a necessidade de fazer duas cirurgias, os
custos elevados, a morbidez do local dador e o facto do grau de vascularização
resultante ser estabelecido a partir da vascularização do tecido do paciente no local da
lesão. O outro processo está relacionado com a introdução de vasos adequados para a
transposição microcrúrgica no interior dos scaffolds, não sendo necessárias as duas
intervenções cirúrgicas do método anterior e não dependendo do estado da
vascularização perto do local da lesão (Amini et al. 2012; Casell et al. 2002; Tanaka et
al. 2003).

3.4. Avaliação dos scaffolds
Após a preparação de biomateriais médicos, como os scaffolds, é necessário avaliar as
suas funcionalidades e o cumprimento dos requisitos para uso humano, através de
ensaios pré -clínicos (Salgado et al. 2004). Para o efeito, recorre-se a ensaios in vitro e
in vivo para testar a biocompatibilidade. Em relação aos primeiros, os scaffolds ou
outros biomateriais são analisados tendo em conta o modo como actuam, em contacto
directo ou indirecto com uma cultura de células. Os resultados baseiam-se na
observação de alterações na morfologia das células. Nos métodos de contacto directo,
normalmente uma suspensão de células é cultivada sobre o biomaterial (ou scaffold) a
analisar e a apreciação do estado das células (vivas ou mortas) é baseada na sua perda
ou não de aderência à cultura, determinando-se assim a citoxicidade do material. Nos
métodos de contacto indirecto, podem ser usadas dois tipos de técnicas. A primeira
46

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

consiste na separação do biomaterial a testar da linha de células usada, recorrendo a
uma barreira de difusão colocada entre o material e as células. Esta barreira é
geralmente formada por uma camada de agar, que contém um corante que é absorvido
pelas células vivas, enquanto as mortas ou danificadas permanecem sem cor. O outro
procedimento utilizado consta na adição de um extrato do biomaterial a uma
monocamada de células, que são posteriormente incubadas. A distinção entre células
vivas ou mortas é também realizada com recurso a um corante. O grande inconveniente
dos estudos in vitro é a necessidade de extrapolação dos resultados para o ambiente
fisiológico, sendo requerida a realização posterior de ensaios in vivo em modelos
animais. No entanto, os testes in vitro minimizam o número de estudos em animais, o
que é uma importante vantagem (Hanson et al. 2004).
Os testes in vivo são efectuados através da implantação dos scaffolds em modelos
animais diferentes (Costa-Pinto et al. 2011). Geralmente os primeiros ensaios são
efectuados em ratos, sendo os scaffolds introduzidos nas zonas intraperitoneais,
intramusculares, mesentéricas e subcutâneas. Estes modelos são úteis para verificar se
características de porosidade e a interligação são adequadas à regeneração óssea, à
vascularização e à osteoindução do tecido (Costa-Pinto et al. 2011; Salgado et al. 2004).
Na última fase dos ensaios pré-clinicos em engenharia de tecidos ósseos devem ser
usados animais com metabolismo, fisiologia e anatomia similares aos humanos, com
intuito de simular o mais possível a situação clínica e o ambiente in vivo. Para o efeito
recorre-se a animais de maior porte, como o porco, a ovelha ou a cabra, que exibem um
peso e uma taxa de remodelação óssea semelhantes à dos humanos (Costa-Pinto et al.
2011). As respostas locais dos materiais inseridos são avaliadas qualitativamente e
quantitativamente, por vários métodos computorizados de histologia, histoquímica,
inumo-histoquímica e bioquímica. Estes métodos permitem a obtenção de dados acerca
da qualidade e quantidade do novo osso, como a sua densidade e estrutura, através da
visualização de imagens que possibilitam a determinação de diversos parâmetros, como
a quantificação da área de tecido ósseo, a espessura e a zona de tecido ósseo não
mineralizado, a área superficial coberta de osteoblastos, o espaço vazio e a espessura
das trabéculas (Hanson et al. 2004; Salgado et al. 2004).

47

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

4. Conclusões
Os problemas ósseos são frequentes em todo o mundo e conduzem à debilidade dos
pacientes. Na tentativa da sua resolução começaram por ser empregues implantes e
próteses ortopédicas que apesar do êxito que alcançaram na melhoria da qualidade de
vida de vários pacientes apresentam várias limitações.
Nos últimos anos os progressos na área da Medicina Regenerativa levaram ao uso de
enxertos ósseos, constituindo actualmente uma terapêutica bem estabelecida, apesar de
também apresentarem desvantagens. A fim de colmatar as restrições desta terapia
emergiu a Engenharia de Tecidos, que tem como base o aumento dos conhecimentos
relativos à composição e fisiologia do tecido ósseo, das células tronco mesênquimais e
do desenvolvimento de novos biomateriais. Nesta área têm vindo a ser utilizadas
matrizes tridimensionais conhecidas por scaffolds, usadas para estimular e auxiliar a
reparação e reconstrução das lesões ósseas. A sua produção tem vindo a ser
aperfeiçoada através do desenvolvimento de novas metodologias e, de técnicas
computorizadas, o que tem permitido melhorar a porosidade, as taxas de degradação e
as propriedades mecânicas dos scaffolds. No entanto, apesar da obtenção de resultados
satisfatórios é necessário desenvolver e estudar novas técnicas de processamento,
principalmente as que conduzem ao aumento das características mecânicas sem
interferir com a porosidade e interligação dos scaffolds.
Com este trabalho de pesquisa bibliográfica é fácil concluir que a Engenharia de
Tecidos ósseos constitui uma terapêutica promissora para a substituição óssea. Além
disso, esta área apresenta um enorme potencial que deve ser desenvolvido, para a sua
afirmação e reconhecimento, tanto pela comunidade médica, como pelo público em
geral.

48

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

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